高浓度抗体制备工艺探究

2021-01-07庄霄玲崔以晴张雪莲

生物化工 2020年6期

庄霄玲，崔以晴，张雪莲

（1.上海复旦大学生命科学学院，上海 200433；2.上海药明生物技术有限公司，上海 200131）

随着单克隆抗体药物的应用日益广泛，临床上对注射体积小、浓度高的抗体制剂需要越来越迫切。该类制剂浓度非常高（通常大于150 mg/mL），无论是样品的制备还是保持样品的稳定性都具有很大的挑战[1]。本文利用正交试验对系统运行的操作参数进行了优化试验，找到了较优的操作条件，并对工艺参数的选择进行了分析探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验中用于超滤渗滤开发的样品均为经过阳离子洗脱的样品，纯度大于99%；醋酸、醋酸钠、氯化钠，购于台山市新宁制药有限公司；组氨酸、组氨酸盐酸盐，购于上海协和氨基酸有限公司；海藻糖，购于日本株式会社林原。所有试剂均符合药用级别。

Pellicon D 30 kD超滤膜包，Millipore公司；Nanodrop 2000微量紫外分光光度计，Thermo Scientific公司；Seven Excellence pH电导率计一体机，Mettler Toledo公司；XPE10002S电子天平，Mettler Toledo公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 超滤整体工艺

起始样品进样流速和跨膜压力（TMP）优化→浓缩→换液缓冲液确定→换液时间点确定→换液→再浓缩→产品回收

室温下，在超滤膜夹具上完成所有超滤实验，并对实验过程中的中间产品进行检测分析，如用NANODROP2000测蛋白的浓度，用HPLC分子排阻法检测单体纯度等。

1.2.2 超滤单因素试验

单因素实验中，固定载量为400 g/m2，样品浓度为15 g/L，超滤膜面积为88 cm2，并处于醋酸缓冲体系中。以超滤膜透过通量作为试验指标，研究蛋白超滤在不同进口流速（11.7 mL/min、23.5 mL/min、35.2 mL/min、46.9 mL/min和 58.7 mL/min），不同的操作温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃），不同跨膜压力（69 kPa、103 kPa、138 kPa、172 kPa、209 kPa）对蛋白透过的影响，然后进一步优化。

1.2.3 超滤实验设计

在“1.2.2”的基础上，考虑到产品质量和过滤效率，固定进口流速为46.9 mL/min，操作温度为28 ℃，然后以缓冲液类型A、样品浓度B和超滤跨膜压力C为自变量，该蛋白的膜透过通量[L/（m2·h）]单体纯度（%）为试验指标，对超滤浓缩换液工艺参数进行优化。如表1所示，正交设计采用3因素3水平[2]。

表1 超滤实验因素水平表

2 结果与分析

2.1 操作温度对膜通量的影响

如图1所示，膜的渗透通量随着料液温度的升高先增大后逐渐降低。在20～30 ℃，随着温度的增加和蛋白质黏性降低，扩散系数和传质系数增加，所以该温度范围内超滤膜膜通量增加明显。而当温度大于30 ℃，超滤膜的透过通量增加速率变缓甚至降低，这可能是因为：（1）当温度超过一定限度后，蛋白有发生聚集的倾向；（2）随着温度升高，膜表面传质效率增加，膜的凝胶层加厚而导致膜孔逐渐堵塞[3]。统计分析表明，料液温度20 ℃、25 ℃、30 ℃之间膜通量差异明显，且结合蛋白质本身性质，后续实验液温度控制为25～30 ℃。

图1 操作温度与膜通量的关系

2.2 进样流速对膜通量的影响

如图2所示，当进口流速从11.7 mL/min增加到58.7 mL/min，膜通量也随之增加，所以进样流速定为58.7 mL/min。

图2 进口流速与膜通量的关系

2.3 跨膜压力对膜通量的影响

如图3所示，当压力从69 kPa增到138 kPa，膜通量增加显著，此时符合非平衡热力学模型的Spiegler-Kedem 方程 Jv=Lp(ΔP-σΔπ)和溶解 -扩散模型，在溶液浓度一定时，膜通量与操作压力呈正相关线性关系，因此压力增大会导致通量增大。当跨膜压力大于138 kPa时，膜通量的增加趋势逐渐平缓并达到拐点值。这可能是由于跨膜压力过大，会加速有些物质在膜孔的堆积，超滤膜会逐渐被浓差极化，导致传质阻力增加，此时溶质浓度达到了其可溶解的极限，可能会因此导致产品跨膜压力与膜通量的关系收率的下降。此外，浓差极化的后期可能导致膜堵塞，会引起膜通量下降且不可逆转[3]。统计分析表明，跨膜压力69 kPa、103 kPa、138 kPa之间膜通量差异明显（P＜0.05），且结合蛋白质本身性质，选取跨膜压力138 kPa为最优条件。

图3 跨膜压力与膜通量的关系

2.4 超滤渗滤正交实验结果

正交试验结果见表2。从生产效率和样品本身稳定性来看，在此蛋白超滤浓缩换液过程中，应当使蛋白在尽可能低的浓度下进行换液，换液缓冲液为组氨酸体系，跨膜压力定为138 kPa，即最优方案为A3B1C2。

表2 试验设计方案与结果

实际超滤浓缩换液生产过程中由于设备和放大操作条件的限制，最佳操作条件可以根据实际情况的变化而稍微作出改变。（1）蛋白浓度对膜通量的影响最具显著性。在实际超滤换液中，低浓度下通量较高，但换液体积大，需要较大超滤膜面积和较多缓冲液体积；而浓度太高时虽然换液缓冲液体积较少，但换液流速太低同样会增加超滤膜面积成本。因此后续经过探索，此蛋白浓缩至70～90 mg/mL时进行换液至组氨酸溶液中。（2）在组氨酸和醋酸缓冲体系中，进口流速为44 mL/min，样品浓度为90 g/L，考察跨膜压力在69～209 kPa下膜的透过通量变化。发现在组氨酸体系中，需要更大的TMP才能达到压力不相关区，推测原因可能是因为缓冲液中存在的一些物质会与目标蛋白发生作用，使其形态发生变化，改变了其在膜包表面达到平衡的条件，所以建议在换液到组氨酸缓冲液后，跨膜操作压力为172 kPa。（3）在实际生产中，虽然较大的切向流量对超滤膜表面有一定的“清洗”作用，从而缓解浓差极化现象。但是随着样品浓度越来越高，粘度越来越大，过高的进口切向流速也可能导致蛋白的活性降低且需要配置更大的泵和更大直径的管道，循环泵损耗大，所以最后确定换液后进样泵速为250 L/(m2·h)。