槟榔江水牛FEZL基因分离鉴定、分子特征及泌乳期多组织差异表达分析

张广乐，吉 丽，王昌全，李成伟，保志鹏，苗永旺*

(1. 云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明650201；2. 云南农业职业技术学院 畜牧兽医学院，云南 昆明 650212；3. 云南省家畜改良工作站，云南 昆明 650224)

前脑锌指蛋白(Forebrain embryonic zinc finger-like protein，FEZL)是锌指蛋白超基因家族中的成员之一。锌指结构是哺乳动物体内最丰富的蛋白质模体[1]。FEZL是包含6个C2H2锌指结构的蛋白和一个甘氨酸重复区域[2]。C2H2型是典型锌指，具有以下同源保守序列：-X-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Lue-X2-His-X2-6-His (X为可变氨基酸)[3]。每个锌指结构是约30个氨基酸的微区，在Zn2+存在时折叠成ββα基序[4]。锌指的串联重复序列通常用于DNA或RNA识别，并且DNA识别由每个手指的α螺旋介导[4-5]。FEZL参与神经元发育的转录调控，已证实神经元发育与机体免疫之间通过下游细胞因子的表达存在关联[6]。

FEZL基因位于普通牛第22号染色体上，包含6个外显子和5个内含子，编码序列 (coding sequence，CDS)全长为1 380 bp，6个外显子的大小分别为27 bp、134 bp、907 bp、135 bp、133 bp和680 bp(登录号：NM_001038198)。在普通牛中发现FEZL基因与乳腺炎相关联。普通奶牛乳腺炎的易感性是由于信号肽5A (semaphorin 5A, SEMA5A) 基因的转录活性较低而导致的免疫反应受损所致[7]。乳腺炎诱导了FEZL基因在乳腺中表达，并通过FEZL诱导表达，进一步促进了SEMA5A的表达，进而诱导了与机体免疫相关的TNF-α和IL-8的表达[8]。FEZL也能诱导SEMA5A在易感牛中表达，但表达水平低于乳腺炎抗性牛[7]。在普通奶牛中发现FEZL基因编码产物的多个甘氨酸残基重复区长度存在12G和13G两种类型，13G/13G 型的FEZL降低了SEMA5A的表达水平，导致该型奶牛对乳腺炎易感，发病率是12G/12G 型奶牛的2倍[9]。目前对水牛、羊等家养动物的FEZL基因研究报道较少。

近年由于高档乳制品的市场拉动，水牛乳业得到了迅猛发展，水牛奶已经成为世界上第二大牛奶供应来源。相比于荷斯坦牛奶，水牛奶含有更高的乳脂、乳糖、乳蛋白和矿物质，营养丰富，具有良好的乳品加工特性[10]。迄今，有关乳腺炎抗性在水牛的研究较少，因此，开展水牛乳腺炎抗性的分子遗传基础研究十分必要。槟榔江水牛(Binglangjiang buffalo, BLJ buffalo)主要分布在云南西部槟榔江流域，其耐粗饲，抗病性强，泌乳性能好，牛奶品质佳，是中国水牛奶业发展的重要遗传资源[11-13]。本研究分离鉴定了槟榔江水牛FEZL基因的编码区，并且通过对其序列的功能生物信息学分析以及采用半定量RT-PCR技术对其进行了基因多组织差异表达分析，以揭示水牛FEZL基因的功能，为阐明水牛乳腺炎抗性的分子遗传基础提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

在云南省腾冲市采集4头成年健康的泌乳期槟榔江水牛组织样品，每头牛分别取心、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、小脑、垂体、乳腺、瘤胃、小肠、十二指肠等组织。采样水牛饲养管理条件一致，年龄、胎次相近，无直接血缘关系。

1.2 组织总RNA提取与cDNA的合成

使用RNA抽提试剂盒(RNAiso Plus, Takara,中国大连)分离组织总RNA，用RNase-free水将产物溶解后检测浓度和完整性。再使用Oligo(dT)18(500 μg/mL)和反转录试剂盒(Invitrogen M-MLV, Takara,中国大连)合成cDNA，并置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.3 引物设计和PCR扩增及测序

以普通牛FEZL基因mRNA序列(登录号为NM_001038198)为模板，使用Primer premier 5软件进行引物设计(表1)，用于分离水牛FEZL基因编码区序列。

表1 水牛FEZL基因引物信息Table 1 Primer information of buffalo FEZL gene

PCR反应体系包含上、下游引物各0.6 μL (10 μmol/L)，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，10×buffer(Mg2+)4 μL，dNTPs 2.0 μL(2.5 mmol/L)，DNA模板(50 ng/μL)2.0 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反应经94 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性45 s， 52.6 ℃退火40 s， 72 ℃延伸1.5 min 进行35个循环，再72 ℃后延伸10 min，终止反应。PCR反应效果经2%琼脂糖凝胶电泳检测，产物经胶回收纯化后进行双向测序，测序所用引物与PCR引物相同。

1.4 半定量RT-PCR检测

以普通牛FEZL基因mRNA序列(GenBank登录号为NM_001038198)为模板，同时以持家基因ACTB(GenBank登录号为NM_001290932)为内参，设计半定量RT-PCR引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

半定量PCR反应体系包含上、下游引物各0.4 μL (10 μmol/L)，mix 5 μL(康为世纪生物技术有限公司)，cDNA模板(50 ng/μL) 1 μL，ddH2O加至10 μL。PCR反应首先94 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性30 s， 65.2 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，进行35个循环，再后延伸72 ℃5 min，终止反应。以2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物的完整性，电泳胶图采用Quantity One软件对分析，获得表达量数据。

采用Lasergene软件包(DNAstar Inc.)对序列进行核对与编辑，得到FEZL基因完整编码区拼接序列，经ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.gov/gorf/)确定开放阅读框(open reading frame，ORF)，相对分子质量和等电点、疏水性、跨膜区和信号肽等理化特征通过在线软件Compute pI/Mw tool、ProtParam tool、ProtScale、TMHMM server 2.0和SignalP 4.1 Server预测分析；采用ProtComp 9.0软件进行FEZL的亚细胞定位；利用SOPMA程序对其蛋白质二级结构进行预测；通过NCBI数据库预测蛋白质的保守结构域；基于同源建模法利用在线服务器SWISS-MODEL预测FEZL蛋白的空间三维结构；通过半定量PCR技术以及Quantity One软件对多组织表达量进行检测；最后采用Mega 4.0软件基于邻接法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增与基因分离鉴定

采用RT-PCR法对FEZL基因进行扩增，PCR产物与预期扩增片段大小相同，电泳结果见图1。

图1 水牛FEZL基因的RT-PCR结果M. DNA相对分子质量标准DL2000;1. PCR产物Fig. 1 RT-PCR products of buffalo FEZL geneM. Marker-DL2000；1. product of PCR

PCR产物经测序得到1 593 bp的序列；通过与已发表的牛科物种序列比较，确定所得序列为水牛FEZL基因序列。槟榔江水牛完整的CDS为1 380 bp，编码459个氨基酸，其氨基乙酸链的长度均为13G型(图2)。将获得的水牛FEZL基因CDS区序列提交到NCBI数据库，获得序列号：MK433000。FEZL基因CDS序列由21.30%A、28.26%G、16.45%T和33.99%C碱基组成。G+C含量为62.25%。水牛FEZL基因及其编码的氨基酸序列见图2。

图2 槟榔江水牛FEZL基因的CDS全序列及其所编码的氨基酸序列.FEZL多肽氨基乙酸链；.保守结构域：COG5048(289-440AA)；___. 起始密码子；*.终止密码子Fig.2 Complete CDS of BLJ buffalo FEZL gene and its encoded amino acid sequence. FEZL glycine chain sequence；. A conservative domainCOG5048 (289-440AA)；___. the start codon;*. the stop codon

2.2 基本理化特征

槟榔江水牛FEZL的基本理化特征与普通牛FEZL(13G型、12G型登录号分别为AY644770，NM_001038198)比较结果见表2。疏水性分析表明水牛FEZL亲水性平均值(GRAVY)为-0.324，表明水牛FEZL属于亲水性的蛋白质(图3)。

表2 槟榔江水牛与普通牛FEZL的基本理化特征Table 2 Basic physicochemical characteristics of FEZL for BLJ buffalo and cattle

图3 槟榔江水牛FEZL疏水性分析分值>0代表疏水性；分值<0代表亲水性Fig. 3 Hydropathy analysis of BLJ buffalo FEZLscore>0 means hydrophobic; score<0 means hydrophilic

2.3 水牛FEZL蛋白的结构特征

槟榔江水牛FEZL蛋白的保守结构域见图4。预测槟榔江水牛FEZL蛋白不含跨膜结构和信号肽，但含有1个COG5048保守结构域(289～440 AA)，为锌指结构域。亚细胞定位分析表明，FEZL定位于细胞核内(支持率为100%)，为在细胞核内发挥功能作用的蛋白质。

图4 槟榔江水牛FEZL蛋白保守结构域Fig. 4 Predicted conserved domain of BLJ buffalo FEZL

预测显示，水牛FEZL中62.9%的AA构成无规卷曲、13.4%的AA构成α螺旋、15.1%的AA构成伸展链，8.6%的AA构成β转折。三维结构预测显示，槟榔江水牛FEZL与鼠锌指蛋白568模板(5wjq.1.C)一致性为42%。该蛋白含有典型的锌指结构，范围在274～446 AA之间，与前面结构域分析基本一致。从FEZL的三维结构来看，水牛与普通牛的13G和12G型都有差异，但与普通牛13G型差异相对较小(图5)。

图5 预测的水牛FEZL蛋白三级结构a、b、c分别是预测的槟榔江水牛、普通牛13G型和12G型FEZL蛋白的3-D结构Fig. 5 Predicted tertiary structure of buffalo FEZL proteina,b and c are the predicted 3-D structures of the FEZLin BLJ buffalo, cattle 13G and 12G, respectively

2.4 序列一致性与系统树分析

水牛FEZL氨基酸序列与13G型普通牛的一致性为99.6%；与12G型普通牛(Bostaurus)、瘤牛(Bosindicus)和山羊(Caprahircus)的一致性为99.3%；与绵羊(Ovisaries)和白尾鹿(Odocoileusvirginianus)的一致性为99.1%；与马(Equusasinus)和澳洲野狗(Canislupusdingo)的一致性为97.8%；与人(Homosapiens)的一致性为97.4%(图6)。基于槟榔江水牛FEZL氨基酸及其同源序列构建的系统发育树见图7。在系统发育树上，水牛与普通牛、瘤牛和山羊、绵羊等聚在一大支上，支持率为99%；而人、马和澳洲野狗聚在另一支上。

图7 基于槟榔江水牛和其他物种的FEZL氨基酸序列的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree based on FEZL aminoacid sequences of BLJ buffalo and other species

2.5 组织差异表达分析

采用半定量RT-PCR方法，检测成年泌乳期水牛FEZL基因在12个器官组织中的差异表达。FEZL基因在水牛大脑中表达量最高，在心、脾、肺、肾、小脑、垂体组织中表达水平次之，在乳腺、小肠、肌肉、十二指肠中有少量表达，在瘤胃中有微量表达(图8)。

图8 泌乳期槟榔江水牛FEZL基因的多组织表达谱ACTB基因表达作为内参;M. DL2000 DNA marker;1. 心脏;2. 脾脏;3. 肺;4. 肾;5. 小脑;6. 大脑;7. 垂体;8. 肌肉;9. 乳腺;10. 瘤胃;11. 十二指肠;12. 小肠Fig.8 Multi-tissue expression profile of FEZL gene inlactating BLJ buffaloThe ACTB expression served as an internal control.M. DL2000 DNA marker;1. heart;2. spleen;3. lung;4. kidney;5. cerebellum;6. the brain;7. pituitary;8. muscle;9. breast;10. rumen;11. duodenum;12. small intestine

3 讨 论

作为锌指蛋白家族中的重要的成员，FEZL在动物体神经发育过程中发挥着重要作用[17]。有研究发现，FEZL基因与普通奶牛的乳腺炎有着密切的关联[6]，但关于FEZL基因在水牛的研究上报道较少。为了阐明该基因在水牛中的功能，基于普通牛FEZL基因的序列，本研究分离鉴定了槟榔江水牛FEZL基因的CDS序列。通过序列测定和序列比对分析，确定所得到的序列就是水牛FEZL基因完整的CDS序列，并进一步预测了其理化特性与结构特征。在FEZL基本的理化特性和结构上，水牛与普通牛较为相似。序列一致性与系统发育分析表明，水牛FEZL氨基酸序列与哺乳类动物特别是牛科物种的FEZL序列一致性较高，在系统树上聚在一起。以上揭示水牛FEZL在功能上与牛科物种的FEZL较一致。通过蛋白质结构特征分析，发现槟榔江水牛FEZL蛋白含有一个COG5048保守结构域，为含有6个C2H2的锌指结构域。该结构域是典型的细胞核内反式作用因子与靶基因调控序列的结合域。近年研究表明，FEZL是一种在神经元发育中起作用的转录因子，据报道FEZL缺陷小鼠显示出过度活跃的行为，表明FEZL在神经元发育中起作用[6]。由此推断，槟榔江水牛的FEZL也是作为细胞核内的一种转录因子，参与了有关基因的表达调控过程。

在普通奶牛中已揭示乳腺炎能够诱发乳腺中FEZL基因的表达，FEZL基因编码产物能够促进细胞中SEMA5A的表达，SEMA5A表达量提高可以引起与机体免疫反应相关的TNF-α和IL-8等多个基因的表达[8]。研究表明，在普通奶牛FEZL基因编码产物存在一个GGC(甘氨酸)的插入突变导致FEZL的氨基乙酸重复区长由12G变成13G, 12G/12G型奶牛SEMA5A的表达水平高，导致多个与机体免疫相关的基因的表达上升，使该型奶牛对乳腺炎表现为抗性，而13G/13G类型奶牛则相反，SEMA5A 的表达水平下降，表现对乳腺炎易感[9]。此外，研究发现，胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)的表达量的增加对奶牛乳腺炎的易感性也有增强作用，13G型FEZL基因比12G型FEZL基因更能增加IGF1R的表达量[14]。河流型水牛乳腺炎只有4%左右的发病率[15-17]，而沼泽型水牛未见有患乳腺炎的报道。本文检测的槟榔江水牛都未感染乳腺炎，本研究及之前检测结果[7]显示，水牛的FEZL均为13G/13G类型，提示水牛FEZL通过SEMA5A信号通路所起的免疫调控作用可能与普通牛有所差异。且在理化特性上，水牛的FEZL与普通牛的FEZL(13G型、12G型)存在一定的差异，主要表现在其疏水性氨基酸与极性氨基酸的组成、不稳定系数及亲水性等方面；在三级结构上，水牛FEZL蛋白的三级结构与普通牛FEZL的两种类型也存在一定差异。这些揭示作为转录因子的FEZL对靶基因的调控，水牛与普通牛存在差异，但这是否与水牛不易患乳腺炎有关，需进一步研究。

本研究通过多组织差异表达分析，检测到FEZL基因在所检测的泌乳期水牛12个组织中都有表达，其中在大脑中的表达量最高，在瘤胃中的表达量最低。这揭示FEZL基因作为一种转录因子，在水牛的多个组织中均发挥作用。该基因在水牛大脑中的表达量最高，揭示该基因与神经功能相关。已有研究发现，在斑马鱼中，FEZL是基底前脑中单胺能(多巴胺能和5-羟色胺能)神经元发育所必需的[18]。Chen等[19]研究发现，在FEZL缺陷小鼠中，深层皮质层中神经元的发育或多或少是异常的，用小干扰RNA(siRNAs)敲除FEZL会改变V层锥体神经元的树突形态。本研究检测到FEZL在水牛乳腺中有少量表达，这揭示FEZL基因参与了水牛的泌乳过程，至于该基因参与水牛的泌乳过程的具体作用机制还需进一步研究。

4 结 论

本研究揭示了水牛FEZL的理化特性及结构特征，发现FEZL基因在检测的所有水牛组织中都有表达，其中在大脑中的表达量最高。初步确定水牛FEZL基因可能在水牛中作为一类核内转录因子广泛参与基因的表达调控过程。确定水牛中FEZL氨基乙酸链的长度均为13G/13G型，鉴于水牛不易感乳腺炎的特性，提示水牛FEZL参与相关基因的调控过程可能与普通牛中有差异。