基于线粒体COⅠ基因的畜禽肉中鸭源性成分鉴别方法研究

盛中伟，唐修君，樊艳凤，贾晓旭，陆俊贤，高玉时

(中国农业科学院 家禽研究所，江苏省家禽遗传育种重点实验室，江苏 扬州 225125)

民以食为天，食以安为先，从源头做好动物源性食品安全，对保障人民群众身体健康和维护社会公共卫生安全具有重要意义[1]。目前，肉与肉制品掺杂、掺假是重要的食品质量安全问题之一，“挂鹅头卖鸭肉”、“假羊肉”、“牛肉膏”等畜禽肉掺假事件频繁发生，严重威胁到消费者的健康和利益，如何快速有效地鉴别出畜禽肉中其它动物源性成分，关系到国计民生，也是各级质监部门对市场秩序维护的迫切需要。

随着生物技术的发展，以DNA为基础的分子生物学技术逐渐产生[2-4]，特别是荧光定量PCR技术的快速发展为肉类成分源性检测开辟了新的途径[5-8]。陆俊贤等[9]以猪特异性基因序列为靶位点设计特异性引物，建立了基于荧光PCR法的猪源性成分快速检测方法。侯东军等[10]根据线粒体环氧酶Ⅲ、细胞色素b和线粒体D-loop基因序列，分别设计了鸭、牛和猪特异性引物，并应用SYBR实时荧光PCR技术，定性识别了鸭、牛和猪源性成分。Dooley等[11]基于线粒体DNA细胞色素b基因，分别建立了畜禽肉中牛源性、猪源性、羊源性、鸡源性和火鸡源性的实时荧光定量PCR检测方法。

动物线粒体基因组DNA具有母系遗传、独立的核外遗传密码以及进化速率快等优点，而且具有高度的物种特异性和多拷贝数，因此线粒体DNA多态性位点已成为设计肉类成分源性检测的首选靶点[12-13]。其中COⅠ基因在动物系统进化、种类鉴别和群体遗传多样性研究等方面得到广泛应用[14]。陈海港等[15]通过对mtDNA中COⅠ基因特异性位点比对和分析，设计并筛选出一对特异性引物XW1，成功的区分出云斑尖塘鳢和线纹尖塘鳢两个物种。齐春萌等[16]根据鸵鸟mtDNACOⅠ基因序列特异性设计特异性引物，建立了肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR鉴定方法。本研究拟根据鸭线粒体DNACOⅠ基因的差异性位点，设计筛选出鸭特异性引物，建立基于线粒体DNACOⅠ基因荧光定量PCR技术的畜禽肉中鸭源性成分快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽肉和鹌鹑肉搅碎混匀成肉糜状，-20 ℃保存备用；基因组DNA抽提试剂盒 北京天根生化科技有限公司；2×PCR Mix 南京博尔迪生物科技有限公司；荧光染料预混液SYBR Green mix：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 2500rxn 南京诺唯赞生物科技有限公司；电泳上样缓冲液 宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 采用离心柱式组织基因组DNA小量抽提试剂盒分别提取9种动物肌肉组织DNA，同时将鸭肉DNA按10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍以及108倍等8个梯度进行稀释，保存于-20 ℃备用。

1.2.2 引物设计与合成 以Genbank上公布的猪、牛、羊、兔、鸡、鸭、鹅、鸽和鹌鹑等9种动物线粒体DNACOⅠ基因序列为靶基因，通过Arraydesigner 2.0、Oligo 6.0、Bioedit、Primer Premier 5.0等软件比对分析，设计合成鸭特异性引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物信息见表1。

表1 引物序列、Tm值及PCR产物大小Table 1 Primer sequence，Tm value and the size of PCR product

1.2.3 常规PCR反应体系和条件 20 μL反应体系：2×PCR Mix 10 μL，10 μmol/L正向、反向引物各0.2 μL，DNA模板1 μL，双蒸灭菌水8.6 μL。反应条件：95 ℃ 预变性5 min； 95 ℃变性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 60 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.2.4 荧光定量PCR反应体系和条件 15 μL反应体系：Master Mix(2×) 7.5 μL；Dye 0.3 μL；1 μmol/L正向、反向引物各0.3 μL；DNA模板1 μL；双蒸灭菌水5.6 μL。反应条件：50 ℃ 2 min； 95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。

1.2.5 灵敏度检测 将鸭肉DNA模板稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍和108倍，以不同浓度DNA为模板，以10 μmol/L正向、反向引物检测方法的灵敏度。反应条件同1.2.3和1.2.4.

1.2.6 数据处理 Real-time PCR扩增结束后，观察扩增曲线图，读取循环阈值(cycle threshold，Ct 值)。若无典型扩增曲线且Ct值大于30，判定检测体系无非特异性扩增。反之则认为检测体系有特异性扩增。

2 结果与分析

2.1 线粒体DNA COⅠ基因常规PCR特异性和灵敏度检测结果

所提取的猪、牛、羊、兔、鸡、鸭、鹅、鸽和鹌鹑等9种动物肌肉DNA模板浓度经测定分别为157.67、141.46、206.52、178.7、174.57、198.24、115.61、191.43和125.62 ng/μL。以9种动物DNA为模板，以鸭线粒体DNACOⅠ基因引物对作为引物进行PCR扩增，结果见图1。由图可见，鸭物种特异引物对仅对鸭肉DNA 模板特异扩增出98 bp大小的条带，而其它物种DNA模板无扩增。将鸭肉DNA模板按10倍梯度稀释，检测方法的灵敏度，结果见图2。由图可见，当DNA模板稀释103倍时，仍可明显见到特异性条带，灵敏度较高。

图1 常规PCR特异性检测结果Fig.1 Specificity test results of PCR

图2 常规PCR灵敏度检测结果Fig.2 Sensitivity test results of PCR

2.2 线粒体DNA COⅠ基因荧光定量PCR特异性检测结果

以9种动物肌肉DNA为模板，按照已优化的条件进行荧光PCR扩增，评价反应体系的特异性，具体见图3、表2。鸭引物只有与鸭DNA模板反应才会有典型扩增曲线，Ct值为24.37；其余反应均无典型扩增曲线，Ct值大于30或无，且无非特异性扩增。

表2 不同动物DNA模板获得的Ct值Table 2 The Ct value of different animal DNA template

图3 鸭引物扩增曲线Fig.3 Amplification curve of duck primer

2.3 线粒体DNA COⅠ基因荧光定量PCR法灵敏度检测

将鸭DNA模板按10倍梯度稀释，分别采用0.03 μL和0.2 μL的引物体积，从DNA水平确定方法的检测下限，扩增结果见表3、图4、图5。可见，当引物体积为0.03 μL时，既有典型扩增曲线，Ct值又小于30的情况下，鸭DNA模板稀释倍数达到102倍，即浓度达到1.98 ng/μL；当引物体积为0.2 μL时，既有典型扩增曲线，Ct值又小于30的情况下，鸭DNA模板稀释倍数可达105倍，即浓度达到1.98 pg/μL。

表3 鸭DNA模板不同稀释倍数获得的Ct值Table 3 The Ct value of different dilution ratio of different animals DNA templates

图4 0.03 μL鸭引物在鸭DNA模板不同稀释倍数下的扩增曲线扩增曲线从左到右稀释倍数依次为稀释10倍、102倍、103倍和104倍Fig.4 Amplification curve of different dilution ratio of 0.03 μL duck DNA primerFrom left to right of amplification curve, the dilutions were 10,102,103 and 104 times

图5 0.2 μL鸭引物在鸭DNA模板不同稀释倍数下的扩增曲线扩增曲线从左到右稀释倍数依次为10倍、102倍、103倍、104、105、106和107倍Fig.5 Amplification curve of different dilution ratio of 0.2 μL duck DNA primerFrom left to right of amplification curve, the dilutions were 10,102,103,104,105,106 and 107 times

3 讨 论

目前，荧光定量PCR技术凭借其独特的优势在食品肉类成分源性鉴别方面的应用越来越广泛，该技术一方面提升了定性检测的准确性，另一方面又使得定量检测成为可能[17-18]，同时荧光定量PCR技术所需要的目标片段较短，样品基本不会受到加工工艺流程等方面的影响。而且随着以线粒体DNA编码基因差异为靶基因进行的食品源性成分鉴定方法的不断出现[12,19]，结合线粒体DNA和荧光定量PCR技术进行肉与肉制品中动物源性成分鉴别的研究技术已逐渐成熟。柳楠等[20]对线粒体16S rRNA引物进行了改进，成功检测出近20种动物源性成分，大大提高了检测的特异性和效率。林彦星等[21]根据鸭mtDNACOX基因上的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，建立了畜禽肉与肉制品中鸭源性成分荧光定量PCR检测方法。

线粒体DNACOⅠ基因位于细胞线粒体中，具有变异位点多、易被通用引物扩增、序列很少存在插入和缺失等优点，已被广泛用作DNA分类的标记基因[14,22]。梁瑞圆等[23]以山东小尾寒羊、洼地绵羊、苏尼特羊、河北小尾寒羊和湖羊为研究对象，利用COⅠ基因特定片段为靶基因，探讨mtDNACOⅠ基因作为DNA条形码鉴定不同绵羊品种和系统进化的可行性。公月月等[24]基于线粒体COⅠ基因序列的特异性，构建了18种观赏鱼的系统进化树，建立了18种观赏鱼的品种鉴定方法。

目前该基因在畜禽肉与肉制品中动物源性成分鉴别研究中报道甚少。本研究主要根据猪、牛、羊、兔、鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑等9种动物线粒体DNACOⅠ基因差异位点设计鸭特异性引物，并进行荧光定量PCR扩增检测，观察扩增曲线和Ct值，对9种动物畜禽肉进行鸭源性成分鉴别，经过多次重复试验证明，所设计筛选的引物对只有在鸭模板DNA存在的情况下才会发生荧光PCR扩增，产生扩增曲线和Ct值，而对其它8种动物肌肉DNA模板无扩增，成功建立了快速、准确的基于线粒体DNACOⅠ基因的畜禽肉中鸭源性成分荧光PCR鉴别方法。研究结果为保障人们舌尖上的安全，打击肉品市场掺假现象，维护市场秩序提供了技术支撑。

4 结 论

线粒体DNACOⅠ基因可以用作畜禽肉中鸭源性成分鉴别的靶基因。根据本研究结果可见本试验所设计筛选的特异性引物对以及所建立的荧光定量PCR方法可以准确有效的进行畜禽肉中鸭源性成分检测。