线粒体自噬抑制剂Mdivi-1调控线粒体未折叠蛋白反应改善癫痫海马神经元损伤

谢南昌，杜丽媛，连亚军，王 翠，孟祥荷，李钰娟，刘凤霞

近年研究指出线粒体功能障碍可能是癫痫的核心发病机制，并与癫痫神经元选择易损性密切相关[1]。线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response,mtUPR)作为新发现的线粒体蛋白质量控制系统，是指在各种应激条件下，线粒体为了维持其蛋白质的稳态，启动由核DNA编码的线粒体热休克蛋白和蛋白酶等基因群转录活化程序的应激反应[2]。在哺乳动物细胞，线粒体基质内蛋白质积累可造成AP-1选择性诱导CHOP而导致线粒体内热休克蛋白HSP60、mtDnaJ和线粒体蛋白酶ClpP表达量升高[3]。因此，mtUPR可及时感知线粒体内蛋白稳态破坏，帮助折叠蛋白恢复正常蛋白构象及协助新合成蛋白正确折叠，防止损害继续扩大[4]。最近，国外研究发现在癫痫动物模型及颞叶癫痫患者中海马神经元HSP60表达水平明显升高[5]。

线粒体自噬是一种选择性的自噬过程，是降解损伤线粒体，维持细胞内环境稳态和线粒体功能的一种重要途径。但过度或者紊乱的线粒体自噬会导致细胞内线粒体过度降解从而引起细胞能量代谢障碍，甚至细胞死亡。近年研究发现能够诱导mtUPR的刺激也最终能够诱导线粒体自噬的发生[6]。以往研究发现线粒体自噬抑制剂Mdivi-1在癫痫海马神经元中发挥神经保护作用[7]，但其对线粒体未折叠蛋白反应的作用仍然未知。

本研究中，我们利用体外海马神经元癫痫模型观察海马神经元CHOP、HSP60和ClpP的动态表达变化，从线粒体未折叠蛋白反应角度探讨癫痫神经损伤的可能机制；并进一步探讨线粒体自噬抑制剂Mdivi-1对线粒体未折叠蛋白反应的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与实验试剂 新生24 h以内健康SD大鼠，SPF级。试剂：无镁外液(2.5 mmol/L KCl、145 mmol/L NaCl、10 mmol葡萄糖、0.002 mmol/L甘氨酸、2 mmol/L CaCl2和10 mmol/L HEPES，pH 7.4)；正常细胞外液(无镁外液各成分+1 mmol/L MgCl2)；PBS液；RIPA裂解缓冲液；线粒体荧光探针MitoSOX(Invitrogen)；Rhodamine123(Sigma)；β-actin、CHOP、线粒体内热休克蛋白HSP60、线粒体蛋白酶ClpP、CytC和caspase-3抗体(CST)；线粒体自噬抑制剂Mdivi-1(Abcam)。

1.2 原代海马神经元的培养 新生24 h内的SD大鼠，用酒精消毒后，断头取脑，将其放置加有预冷PBS的培养皿中，在无菌条件下分离双侧海马组织并将其表面血管剔除后，剪成约1 mm3的组织块至15 ml离心管中，加入0.125%的胰酶在37 ℃恒温箱消化15 min，期间轻微震荡数次后加入PBS洗涤并终止消化，以1500 r/min转速离心5 min后弃上清，用PBS洗涤后加入种植培养液制成细胞悬液。调整细胞密度为4×105个/孔接种于预先用0.01% L-多聚赖氨酸包被的6孔培养板中，置于37 ℃恒温箱、5% CO2培养箱中培养4 h后等量更换为维持培养液继续培养，之后每2 d半量更换维持培养液培养至14 d即可用于后续的实验。

1.3 大鼠海马神经元癫痫模型的建立与实验分组

1.3.1 造模 用维持培养液培养至14 d后，弃去维持培养液，用无镁外液冲洗3次后加入无镁外液培养3 h诱导海马神经元癫痫模型。

1.3.2 实验分组 将原代海马神经元随机分为：(1)对照组(CON组)：正常细胞外液处理神经元3 h后继续用维持培养液培养；(2)无镁诱导组(AE组)：用无镁外液分别处理神经元3 h、12 h、24 h后继续用维持培养液培养；(3)AE+DMSO组(阴性对照组)：用5 μl DMSO处理神经元30 min后继续用维持培养液培养，最后用无镁外液分别处理神经元3 h；(4)AE+Mdivi-1组：将25 μmol Mdivi-1溶解于5 μl DMSO中处理神经元30 min后继续用维持培养液培养，最后用无镁外液分别处理神经元3 h。

1.4 神经元纯度检测 海马神经元在放置有爬片的24孔板中生长至7 d可进行NSE染色鉴定神经元纯度。弃去培养液，用PBS漂洗一遍后用4%多聚甲醛固定30 min后，PBS漂洗3次，每次5 min；然后用0.2% TritonX-100破膜5 min，吸弃TritonX-100后，用PBS漂洗3次，每次5 min；加入兔抗大鼠NSE多克隆抗体4 ℃过夜，TBST漂洗3次，每次5 min；加入山羊抗兔荧光二抗，避光孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min；滴加10 μl含DAPI的抗荧光衰减封片剂于载玻片上，取出细胞爬片并盖在载玻片上。在400倍荧光显微镜下随机选择10个视野观察，计算NSE阳性细胞率并取均值即为神经元纯度。

1.5 线粒体ROS生成水平检测 利用线粒体荧光探针MitoSOX评估线粒体ROS生成水平。胰蛋白酶处理原代小胶质细胞，然后用5 μmol/L MitoSOX工作液37 ℃避光孵育15 min，PBS清洗，再通过流式细胞术来评估线粒体ROS生成水平，结果通过各单位的荧光强度来表示。

1.6 线粒体膜电位水平检测 利用Rhodamine123检测线粒体膜电位水平。弃去细胞上清液后用PBS缓冲液清洗，然后加入Rhodamine123染液5 μg/ml，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中孵育10 min，PBS清洗后，用流式细胞术评估线粒体膜电位水平，结果通过Rhodamine123的荧光强度来表示。

1.7 Western blotting分析 检测CHOP、HSP60、ClpP、CytC、caspase-3蛋白表达水平。加入RIPA裂解缓冲液裂解各组海马神经元提取蛋白，BCA法检测各组蛋白浓度，调整上样体积至每个泳道蛋白量相等；12% SDS-PAGE凝胶电泳(上层胶80 V 30 min，下层胶120 V 90 min)，电泳结束后将胶上的蛋白质条带转移至PVDF膜上；5%脱脂奶粉封闭2 h；一抗β-actin(1∶3000)、CHOP(1∶500)、HSP60(1∶1000)、ClpP(1∶1000)、CytC(1∶1000)、caspase-3(1∶500)孵育，4 ℃过夜；10% TBST洗膜3次，每次10 min；二抗常温孵育1 h，10% TBST洗膜3次，每次10 min；最后使用增强化学发光法观察。

2 结 果

2.1 神经元纯度检测 体外原代培养海马神经元(见图1A)，并对神经元采用NSE免疫荧光染色后，在荧光显微镜下可观察到其胞质和树突着红色荧光，胞核着蓝色荧光。结果(见图1B)所示，在荧光显微镜下随机选取10个视野观察并计数，计算其均数得神经元纯度在95%以上。

A：体外原代培养海马神经元；B：NSE染色海马神经元

2.2 癫痫海马神经元CHOP、HSP60和ClpP表达变化 与对照组相比，AE组(3 h、12 h、24 h)CHOP和HSP60蛋白的表达量均显著增多，且在12 h内，CHOP表达量与时间呈正相关，12 h后有所下降。与对照组相比，AE组(3 h、12 h、24 h)ClpP蛋白的表达量均显著增加，且与时间呈正相关。差异具有统计学意义(P<0.05，见图2)。

图2 癫痫海马神经元CHOP、HSP60和ClpP表达变化

2.3 Mdivi-1对线粒体未折叠蛋白反应的影响 与AE组相比，Mdivi-1使海马神经元CHOP、HSP60和ClpP的表达量增加，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。与AE组相比，DMSO组(阴性对照组)CHOP、HSP60和ClpP表达量无显著差异(P>0.05，见图3)。

图3 Mdivi-1对海马神经元CHOP、HSP60和ClpP表达变化的影响

2.4 Mdivi-1对海马神经元线粒体ROS生成及线粒体膜电位影响 与对照组相比，AE组海马神经元线粒体ROS生成增多以及线粒体膜电位降低(P<0.05，见图4)。与AE组相比，Mdivi-1使海马神经元线粒体ROS生成显著减少，线粒体膜电位增加(P<0.05，见图4)。与AE组相比，DMSO组海马神经元线粒体ROS生成及线粒体膜电位无显著差异(P>0.05，见图4)。

图4 A：各组海马神经元线粒体ROS生成变化；B：各组海马神经元线粒体膜电位变化

2.5 Mdivi-1对海马神经元CytC水平及caspase-3激活的影响 与对照组相比，AE组海马神经元cyto-CytC水平升高并且caspase-3激活增加，而mito-CytC水平降低(P<0.05，见图5)。与AE组相比，Mdivi-1使海马神经元cyto-CytC水平降低且caspase-3激活减弱，而mito-CytC水平升高(P<0.05，见图5)。AE组和DMSO组海马神经元CytC水平及caspase-3激活无显著差异(P>0.05，见图5)。

图5 各组海马神经元CytC水平及caspase-3激活变化

3 讨 论

本研究证实癫痫海马神经元中线粒体未折叠蛋白反应增强，并且线粒体自噬抑制剂Mdivi-1可以通过增强线粒体未折叠蛋白反应对癫痫海马神经元发挥保护作用。进一步研究发现Mdivi-1可以减少线粒体ROS生成以及恢复线粒体膜电位，并且Mdivi-1通过减少CytC释放和caspase-3的激活从而减少海马神经元凋亡，这些研究发现为癫痫治疗提供了新思路。

线粒体蛋白正确折叠和转运对维持线粒体功能至关重要[8,9]。研究表明癫痫发作可引起线粒体氧化呼吸链损伤，ROS水平上升，ATP水平下降，线粒体跨膜电位下降及Ca2+紊乱等线粒体功能障碍[10]。另外研究发现线粒体氧化应激会降低线粒体导入效率，从而导致线粒体蛋白质量控制失衡，并且大量ROS会干扰线粒体蛋白质折叠环境从而触发mtUPR[11,12]。研究表明在应激环境下HSP60水平升高能促进线粒体蛋白质高效折叠，其主要折叠相对较小的，可溶性的单体蛋白[13,14]。而CLpP能识别错误折叠的蛋白并将其降解为8～20个氨基酸的多肽[15]。本研究结果显示癫痫海马神经元较对照组CHOP、HSP60和CLpP表达量显著增加，提示癫痫海马神经元mtUPR被激活，并可通过mtUPR恢复线粒体蛋白质稳态和维持线粒体正常功能。

线粒体受损时，除了mtUPR被激活，PINK1介导的线粒体自噬途径也被激活[16]。研究表明当线粒体导入效率轻微受损即可激活mtUPR，而PINK1需要在线粒体外膜上大量积累才可激活线粒体自噬[17,18]。这提示线粒体损伤较轻时，优先激活mtUPR来恢复线粒体功能。当线粒体损伤较重时，线粒体自噬相关的PINK1和Parkin与HSP60互动关闭mtUPR，并激活线粒体自噬，清除受损严重的线粒体。本研究发现粒体自噬抑制剂Mdivi-1可增加癫痫海马神经元CHOP、HSP60和CLpP表达量，使线粒体ROS生成减少、线粒体膜电位恢复，并减少CytC释放和caspase-3激活，提示抑制线粒体自噬可通过增强mtUPR来使过度受损的线粒体恢复正常功能，并且进一步减少海马神经元凋亡。

综上所述，在无镁外液致痫海马神经元中mtUPR被激活，并且线粒体自噬抑制剂Mdivi-1可通过增强mtUPR发挥癫痫神经保护作用，其机制可能是通过减少线粒体ROS生成、恢复线粒体膜电位及减少CytC释放和caspase-3激活发挥神经保护作用，这也表明mtUPR有望成为癫痫治疗的新靶点。