日本乙型脑炎病毒GⅢ型标准品质粒的构建

饶清，何文姬，龙淑英，蒋鸿超，孙强明，张桢

(1.昆明医科大学附属儿童医院 昆明市儿童医院检验科，昆明 650228； 2.云南省儿童重大疾病研究重点实验室昆明市儿童医院儿科研究所，昆明 650100； 3.中国医学科学院医学生物学研究所 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，昆明 650118)

黄病毒包括许多重要的人类病原体，它们通过蚊子(黄热病毒、登革病毒、寨卡病毒、西尼罗病毒和日本乙型脑炎病毒)或蜱虫(森林脑炎病毒)传播给脊椎动物宿主。寨卡病毒、西尼罗病毒和登革病毒的暴发和流行区域的急剧扩张在历史中均有记载，这突出了黄病毒作为新兴病原体的影响[1-2]。日本脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的媒介传播的人畜共患病，通过库蚊叮咬传播，主要为三带喙库蚊。由于预计库蚊和伊蚊的地理区域将会增加，会出现新的JEV疫区，特别是考虑到亚热带和温带地区湿度增加，平均气温升高使其成为潜在的疫区[3-6]。JE的临床表现通常以非特异性发热性疾病开始，包括头痛、散发性鼻炎和胃肠道症状，随后进展为神经系统症状，包括严重抽搐、脑膜炎/脑膜脑炎，或脊髓灰质炎样疾病[7]。JEV引起的脑炎是东亚、东南亚和南亚地区病毒性脑炎的主要形式[8]。世界上近60%的人口，超过30亿人生活在JEV流行地区[9]。JEV的主要易感人群是15岁以下儿童，病毒潜伏期为5～15 d。每年报告的JE病例超过6.8万例，其中20%～30%的病例是致命的，死亡率为14%～21%，且多达50%的幸存者可能出现长期的神经后遗症[10-11]。JE患者传统的诊断方法为世界卫生组织推荐的IgM抗体捕获酶联免疫吸附法检测患者血液或脑脊液样本中的抗乙脑IgM抗体。然而，目前该诊断方法存在公认的局限性[12-13]。本研究旨在构建JEV GⅢ型拷贝数的标准品质粒以助于JE的早期防控，并为JEV GⅢ型后期的研究提供指导。

1 材料与方法

1.1菌株、载体 BHK-21细胞、JEV GⅢ型由中国医学科学院医学生物学研究所提供；pMD19-T载体购于日本TaKaRa公司；大肠埃希菌DH5α购自昆明硕擎生物科技有限公司。

1.2主要试剂及仪器 RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司，逆转录试剂盒、DNA分子质量标准、loading buffer、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)MIX购自宝日医生物技术(北京)有限公司，质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自北京TIANGEN公司，荧光定量试剂购自北京TSINGKE公司；CFX96 Real-Time PCR仪购自美国Thermo Fisher公司，超微量分光光度计购自德国IMPLEN公司。

1.3JEV在适应株上的培养 准备两瓶T25 BHK-21细胞(分别为对照组和实验组)，状态良好，致密单层，弃上清，用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次。对照组细胞于37 ℃加入2.2 mL 5%的最小必需培养基(minimal essential medium，MEM)，5% CO2的培养箱吸附2 h，每20分钟晃动细胞培养瓶，使病毒均匀吸附。2 h后补加8 mL 5%的MEM病毒维持液,置于培养箱培养4～5 d，倒置显微镜下观察实验组细胞病变程度(++++)，将细胞放入-80 ℃冰箱冻存。次日，将细胞反复冻融3次后经0.22 μm过滤器收集病毒液，分装后-80 ℃冻存，即为获得的病毒液。实验组细胞加入200 μL JEV和2 mL 5%的MEM(5%的MEM：MEM+5%胎牛血清+1%双抗+2%谷氨酰胺+2% NaHCO3)。

1.4标准品质粒的构建 NCBI数据库下载JEV标准序列(GenBank:MH258853)，设计特异性引物扩增乙脑病毒PrM蛋白区部分基因序列。上游引物Forward：5′CCAGGGGAAGCTTTTGAT 3′，下游引物Reverse：5′ACGCGTTGACCGTTGTTA 3′。按照试剂盒操作流程提取病毒液中的基因组RNA，得到的乙脑病毒基因组RNA通过反转录-PCR扩增乙脑病毒PrM蛋白区域，扩增条件为98 ℃ 2 min预变性；98 ℃ 10 s，52.6 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。1%的琼脂糖凝胶确认扩增产物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，随后将回收产物连接到pMD-19T克隆载体上。转化DH5α感受态细胞后，涂布于含100 μg/mL氨苄西林抗性的LB(Luria-Bertani)固态平板，培养箱37 ℃过夜培养。挑取单个菌进行单克隆培养，提取质粒进行双酶切(Sal1、Bamh1)，测序(昆明擎科生物有限公司)鉴定结果为JEV GⅢ PrM蛋白区目的基因序列；将序列鉴定正确的阳性菌株进行培养，获得JEV标准品质粒，并用超微量分光光度计测定乙脑病毒标准品质粒的浓度。标准品质粒的拷贝数计算公式：(Amount×10-9×6.022×1023)/(Length×660)= Number of copies(copies/μL)。其中，Amount为超微量分光光度计测得标准品质粒浓度(ng/μL)，Length代表模板DNA长度，带入公式中得到乙脑病毒标准品质粒拷贝数。

1.5标准质粒体系的建立 根据JEV PrM蛋白区目的基因序列设计实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)特异性引物：上游 Forward primer：5′TCAACGAAAGCCACACGA 3′；下游Reverse primer：5′GTACCGCCGCCAGGAAAG 3′。将JEV标准质粒用无核酸酶的水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度稀释至10-9，按推荐反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR (预变性：95 ℃ 60 s；95 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s进行40个循环；72 ℃ 延伸15 s)检测标准品质粒扩增效率和特异性。根据RT-qPCR获得标准品质粒的扩增曲线与熔解曲线。同时以得到的Ct值作为X轴，标准品质粒拷贝数Log10作为Y轴绘制标准品质粒的标准曲线，从而得到JEV标准品质粒的标准曲线方程。

1.6JE患者血清中病毒拷贝数定量检测 取JE患者血清1份(西双版纳人民医院提供)150 μL按RNA病毒提取试剂盒(购自德国QIAGEN公司)提供的操作方法获得40 μL基因组RNA，随后取6 μL RNA逆转录得到20 μL互补DNA。取2 μL互补DNA，连续用无核酸酶的水按10倍梯度稀释至10-1～10-4，每个梯度设置3个复孔。利用标准品质粒标准曲线计算每管病毒拷贝数，病毒拷贝数=(每管病毒拷贝数×20×40)/(150×6)。

2 结 果

2.1JEV prM区域片段的获得 特异性引物扩增得到的目的片段产物通过1%琼脂糖凝胶电泳后，经核酸成像仪可见目的条带单一且大小为441 bp条带(图1),测序结果经BioEdit软件比对表明序列正确。

JEV：日本乙型脑炎病毒；PCR：聚合酶链反应；1：目的条带；DNA Marker：DL2000 DNA Marker (DNA标准分子质量)

2.2JEV标准品的鉴定 构建好的JEV标准品质粒利用Sal1酶和Bamh1酶进行双酶切于37 ℃培养箱过夜。酶切产物通过1%的琼脂糖凝胶后，经核酸成像仪可见两个目的条带，大小约477 bp和2 656 bp(图2)，对条带进行回收测序表明结果无误。

JEV：日本乙型脑炎病毒；1：标准质粒的酶切条带；Marker：DL2000 DNA Marker(DNA标准分子质量)

2.3标准曲线的绘制及JE患者血清中拷贝数的测定 通过RT-qPCR得到标准品Ct值，乙脑病毒标准品质粒Amount为153 ng/μL，DNA Length为3 049，从而得到JEV标准品质粒10倍梯度倍比稀释对应的病毒拷贝数(由于10-1标准品质粒浓度高达到了仪器默认的阈值，未检测到Ct值)。标准品稀释度Ct平均值、反应体系中的标准品拷贝数和标准品拷贝数的Log10，见表1。最后以标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数Log10作为Y轴绘制JEV标准品质粒的标准曲线(图3)，得到标准品质粒的标准曲线方程：y=-0.288 9x+11.516，R2=0.993。

表1 JEV标准品质粒对应稀释度的Ct值、拷贝数及拷贝数的Log10

JEV：日本乙型脑炎病毒

2.4JE患者血清原液及倍比稀释的样品拷贝数 根据RT-qPCR获得标准品质粒的扩增曲线与熔解曲线，见图4。同时以得到的Ct值作为X轴，标准品质粒拷贝数Log10作为Y轴绘制标准品质粒的标准曲线，得到JEV标准品质粒的标准曲线方程y=-0.288 9x+11.516。利用得到的JEV标准品质粒的标准曲线方程推算出JE患者血清原液及倍比稀释的样品拷贝数分别为1 184 130.27、120 912.86、10 736.84、1 053.45、121.25 copies/μL，见表2。

表2 JEV血清原液及梯度稀释样品检测结果

3 讨 论

1964年，从日本首次报道的流行病例中分离出JEV[14]。根据病毒包膜基因，将JEV分为5种基因型：JEV(GⅠ)、JEV(GⅡ)、JEV(GⅢ)、JEV(GⅣ)和JEV(GⅤ)[15]。研究表明，JE的发病常见于南亚和东亚，包括中国、尼泊尔和印度[16]。

在JEV导致的脑炎患者中，50%的病例会导致永久性的神经精神后遗症，如瘫痪和智力残疾[17]。JEV的发病率和死亡率较高，但目前仍没有预防神经症状发展的治疗方法[18-19]。对于JEV最有效的方法为疫苗接种。疫苗的使用极大地降低了乙型脑炎的发病率，然而对成本、供应、不良反应和有效性的考虑使中低收入国家难以实现疾病控制[16]。目前，亚太地区有30多亿人面临JEV的传播风险[20]。该病的全球负担和相关死亡率仍较高，因此有必要实现更高的疫苗接种覆盖率。据报道，日本目前使用的JEV疫苗在Muar株(JEV GⅤ原型株)上引起的中和抗体滴度水平低于在JEV GⅠ和GⅡ上[21]。未来，JEV疫苗的研发应对GⅠ～GⅤ型同样适用。

以往JEV的诊断均是通过检测患者血液或脑脊液样本中的抗乙脑IgM抗体，但该方法存在一定的局限性。本研究构建的JEV GⅢ质粒标准品在10倍梯度稀释下Ct值稳定，同时对患者梯度血清稀释样品(10-1～10-4)的检测结果显示Ct值稳定(每个梯度设置3个复孔，且数值相差在0.5以内)，熔解曲线特异性好，表明该标准品质粒对病毒的早期检测灵敏、高效、稳定，可为实验室研究JEV提供便捷手段。目前，大多数日本乙型脑炎患者的治疗目的是降低死亡率或改善治疗效果，仍没有药物可以完全阻止JEV进入细胞或其在人体的复制，或治愈JEV感染[22]。

JEV：日本乙型脑炎病毒

此外，临床缺乏针对日本乙型脑炎患者的特效药物，而本研究构建的标准品质粒可为未来抗JEV药物的筛选及相关机制的研究提供策略。

然而，本研究也存在不足。虽然在亚洲JE患者主要由GⅢ型引起，但其他血清型病毒患者仍然存在。JEV各基因型的分布与地理区域有关。中国分离的JEV主要为 GⅠ、GⅢ、GⅤ基因型[23]。GⅠ基因型能进一步分为两个亚型：GⅠ-a和GⅠ-b，其中GⅠ-a的分布局限于泰国和柬埔寨，而GⅠ-b是目前JEV分离株中最常见的基因型[24]。1935—1980年，GⅢ是JEV流行区域的主要基因型，此后逐渐被GⅠ-b取代[24-26]，这一趋势在亚洲其他许多地区已观察到，并反映了其复制效率高[27]，还表现出对极端温度的耐受性[28]。目前，JEV GⅢ型仍是优势基因型。本研究构建的JEV GⅢ型质粒标准品适用于大多数患者，但对于JEV其他血清型患者是否适用仍不清楚，后期有必要针对其他血清型JEV进行检测。

综上所述，本研究构建好的JEV质粒标准品不仅可提高JEV的检测效率，还能对病毒研究过程中的病毒载量进行动态监测。