梅毒免疫印迹法在梅毒血清固定患者诊断中的临床应用

王欣俞，赵晋文，焦曼玉，张钰旗，王鑫琪，刘紫旺，刘千赫，杨微，刘缘，张春红，张海关，张凯，王琳，王立强

(河北燕达医院 a.检验科，b.皮肤科，c.老年病科，d.健康体检科，河北 廊坊 065201)

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponempallidum,Tp)感染引起的一种慢性多阶段发展的性传播疾病，虽然青霉素对Tp治疗有效，但梅毒感染仍在世界范围内普遍存在，特别是发达国家和发展中国家的男同性恋者梅毒感染率急剧增加。随着梅毒发病率的升高，梅毒血清固定确诊的概率也随之上升。目前尚无疫苗进行特异性预防，早期诊断对梅毒防控意义重大，影响成人与新生儿身心健康[1-3]。梅毒实验室检查包括直接病原体检查、血清学试验和核酸扩增试验。临床梅毒筛查和诊断常用血清学试验，包括非Tp血清学试验和Tp血清学试验[4]。随着基因工程技术和Tp全基因测序的快速发展，以TpN47、TpN17、TpN15和TpN45为包膜抗原的血清学试验具有高灵敏度和特异度[5-6]。重组诊断抗原的检测方法极大促进了特异、快速、精准的梅毒血清学诊断。蛋白印迹法为国际公认的梅毒确诊方法[7]，通过大肠埃希菌表达的重组蛋白作为诊断抗原，测定特异性Tp抗体[8]。本研究主要探讨梅毒螺旋体免疫印迹法(Treponemapallidum-western blot，TP-WB)在梅毒血清固定患者诊断中的临床应用，评估梅毒血清固定患者的诊断及治疗。

1 资料与方法

1.1一般资料 使用美国雅培i2000化学发光微粒子免疫分析仪对2017年6月至2020年1月河北燕达医院收治的57 612例患者进行梅毒血清学筛查，选取36例梅毒筛查化学发光微粒子免疫法(chemiluminescence microparticle immunoassays，CMIA)相对发光单位(relative light unit,RLU)/cut-off RLU(S/CO)值≥1的梅毒血清固定患者作为血清固定组，30例S/CO值<1的患者作为对照组。血清固定组纳入标准：梅毒经过正规驱梅治疗；排除重复感染和可能引起非Tp抗原反应素试验假阳性的因素及神经梅毒；非Tp抗原素试验长期维持在低滴度不阴转[9]。本研究获得河北燕达医院伦理委员会批准。

1.2方法 采用Tp抗原试验CMIA和快速血浆反应素环状卡片试验(rapid plasma reagin circle card test，RPR)法对血清固定组和对照组样本进行检测，以TP-WB法(金标准)进行确证；并根据RPR法基线滴度对血清固定患者进行分组，其中O组为原倍阳性(1∶1)，A组、B组、C组、D组分别滴度为1∶2、1∶4、1∶8和1∶16稀释。

CMIA法为Tp抗原试验检测Tp特异性抗体，采用CMIA试剂盒(美国雅培公司生产，批号：08519BE01)说明书结果判读，S/CO值≥1认定为反应性，S/CO值<1认为非反应性。随后采用RPR法(RPR试剂盒，上海科华公司生产，批号：20170904)监测病程。采用TP-WB法(TP-WB法试剂盒,德国欧蒙医学实验室诊断公司生产，批号：D191028AC)进行梅毒血清学确证,依据EUROLineScan软件判读抗原带着色的深浅，结果判读标准：抗原带着色强度0～13为阴性，14～23为灰区，≥24为阳性，仪器判读检测线性为0～255。至少两条特异性抗原带着色强度≥24为阳性；一条特异性抗原带着色强度≥24为可疑阳性[4]。

1.3统计学方法 将检测的原始数据保存为CSV格式的数据矩阵，格式参照通用数据统计分析平台MetaboAnalyst 4.0(https://www.metaboanalyst.ca)要求。数据上传后不经数据转换或归一化，采用平台的统计分析模块进行多元统计分析和数据可视化，具体步骤如下：相关性分析采用Pearsonr距离法；采用One-way ANOVA & post-hoc Tests进行组间差异比较，其中Post-hoc analysis采用Fisher′s LSD；采用主成分分析Biplot对不同指标的影响因子及相关关系进行可视化；采用偏最小二乘判别分析的变量重要性投影(variable importance in projection，VIP)方法对不同分组关键因素进行可视化，并计算VIP值，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1血清固定组和对照组血清学检测结果 血清固定组中CMIA法及RPR法均为阳性，TP-WB检测中TpN15抗体32例反应性，TpN17抗体30例反应性，TpN45抗体35例反应性，TpN47抗体26例反应性，根据诊断标准显示，血清固定组中36例均为阳性(表1)。对照组中CMIA法S/CO值<1，结果判读均阴性；RPR滴度法显示，1∶2阳性1例，阴性29例；TP-WB中TpN15及TpN47反应性各1例(备注着色强度分别为14和17，结果判读为阴性)，即对照组30例均为阴性(表1)。梅毒血清固定组代表性样本TP-WB方法检测结果见图1，着色反应条带中从左至右依次为TpN15、TpN17、TpN45、TpN47，其中TpN47显色强度最低，TpN15、TpN17、TpN45对应的条带着色强度较高，且不同程度展宽。

表1 血清固定组和对照组RPR滴度分布及TP-WB抗体表达的比较 (例)

2.2血清固定患者RPR基线滴度中EUROLineScan软件判读TP-WB抗体着色强度及5组VIP分析结果 血清固定患者RPR基线滴度中EUROLineScan软件判读TP-WB抗体着色强度，O组(n=13)、A组(n=6)、B组(n=5)、C组(n=6)、D组(n=6)不同基线滴度样本TpN15、TpN17、TpN45和TpN47的色带着色强度不同。其中TpN15读数范围为6～129，TpN17读数范围为0～119，TpN45读数范围为7～109，TpN47读数范围为0～58，CMIA读数范围为3～24，样本读数分布见图2a。血清固定患者RPR法基线滴度分组中TP-WB四种抗体表达水平的VIP分析结果显示，TpN15、TpN17、TpN45、TpN47及CMIA值的VIP得分分别为1.34、1.18、0.99、0.90、0.03，见图2b。

Tp：梅毒螺旋体；TP-WB：梅毒螺旋体免疫印迹法

2.3基于RPR滴度分组的TpN15、TpN17、TpN45、TpN47及CMIA差异分析 采用一元方差分析对不同分组中的读数进行差异比较，结果见图3a，其中差异显著的因子为TpN15，不同分组差异显著性比较见图3b。TpN15抗体表达水平由高到低依次为B组>C组>A组>O组>D组，其中B组显著高于D组(t=4.137，P=0.008)。

Tp：梅毒螺旋体；CMIA:化学发光法；Compounds:因子；RPR value：RPR滴度值；A组、B组、C组、D组、O组为基于RPR法基线滴度的血清固定患者分组

2.4相关性分析结果 TP-WB法TpN15、TpN17、TpN45、TpN47抗原条带读数与CMIA读数均呈正相关(r=0.510，P=0.001；r=0.540，P=0.001；r=0.600，P<0.001；r=0.410，P=0.010)(图4a)，各因子之间夹角均为锐角，Biplot分析结果见图4b；根据箭头长度各读数的影响大小依次为TpN15>TpN17>TpN45>TpN47>CMIA。

3 讨 论

梅毒血清固定是指梅毒患者经过规范的抗梅毒治疗和一定时间随访非Tp血清RPR试验维持在一定滴度,主要与性别、年龄、感染阶段、RPR基线滴度、无症状神经梅毒、吉海反应、Tp亚型14i/a、细胞免疫功能状态相关。有研究显示，女性、潜伏梅毒、非青霉素治疗与血清固定呈正相关[10-11]。研究报道,有35.2%～44.4%的梅毒患者会发生血清固定，有35%的血清固定患者可能重新发展成显性梅毒[12-13]，这些显性梅毒患者可发生神经或心血管梅毒以及胎儿宫内感染等，其复发和持续存在临床不容忽视。梅毒复发分为血清复发和临床复发两种，以血清复发多见[14]。美国疾病预防控制中心将血清复发定义为梅毒治疗后6个月非Tp抗体滴度与治疗时的基础滴度或最高滴度相比升高4倍[10]。在Tp致病过程中位于细胞内膜层的膜脂蛋白是Tp重要的毒力因子，参与宿主黏附、定植、播散以及激发机体免疫反应，对宿主的固有免疫系统具有很强的调控作用[15-17]。TpN15功能仍不明确；TpN17为β桶状蛋白[18]，在维持膜结构、通过激活内皮细胞中表达黏附分子和趋化因子等方面起重要作用[19]；TpN47是一种羧肽酶，能促进微血管内皮细胞合成细胞间黏附分子-1以及诱导血管间黏附分子[20]。TP-WB法包被重组抗原TpN15、TpN17、TpN47以及TpN45，与Tp引起的梅毒免疫反应密切相关，灵敏度和特异度高[21]。

Tp：梅毒螺旋体；CMIA:化学发光法

本研究基于RPR法基线滴度值对梅毒血清固定样本进行了分组，同时采用TP-WB法和CMIA法对样本进行检测，对不同方法读数进行分析和比较。结果显示,不同样本TpN15、TpN17、TpN45和TpN47的色带着色强度不同，TP-WB法各抗原条带读数与CMIA读数均呈正相关，不同抗原反应与RPR基线滴度相关。对照组中1例血清特异性抗体CMIA法检测结果阴性，RPR法检测结果滴度为1∶2，其非特异性抗体存在假阳性反应。相关文献报道，人类免疫缺陷病毒感染、自身免疫性疾病、免疫接种、妊娠、注射吸毒和老年人中可能出现非特异性抗体试验假阳性结果[22]。梅毒血清固定可能是机体的一种特定免疫状态，而与Tp的持续存在无关[23]。TP-WB中抗体表达提示梅毒血清固定患者免疫状态。

综上所述，在梅毒血清固定患者中TP-WB不同抗体与RPR基线滴度相关，TP-WB中抗体表达具有重要的诊断价值，CMIA法、RPR与TP-WB法联合检测有利于提高梅毒血清固定诊断价值。但本研究也存在不足之处，由于临床梅毒血清固定患者样本量少，研究对象的变化程度不一，研究结果存在一定的局限性。未来应联合多中心、大样本的临床研究设计，建立数据库，为梅毒实验诊断以及抗梅毒血清固定患者治疗提供新思路。