河北省部分地区猪圆环病毒3型分子流行病学调查及遗传变异分析

王会杰， 仇国明， 轩秋燕， 马贵达， 顾文源， 王金凤，刘立兵， 王建昌， 张若曦， 韩庆安

(1.河北省生猪产业创新团队秦皇岛综合实验站 秦皇岛市畜牧工作站， 河北秦皇岛066000 ；2.河北省动物疫病预防控制中心， 河北石家庄050035 ； 3.石家庄海关技术中心， 河北石家庄050051)

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员[2]，基因组为单股环状DNA，是迄今发现最小的动物病毒[1]。PCV包含PCV1和PCV2两种亚型，2016 年美国学者 Palinski 等[2]报道在患有猪皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍的母猪及其流产胎儿体内发现了一种新型的猪圆环病毒，将其命名为猪圆环病毒3型 (PCV3)，至此，PCV分为3种亚型。PCV3感染可导致母猪出现厌食症状，皮肤出现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，生产性能下降 ； 妊娠母猪发生繁殖障碍，产弱胎、死胎、木乃伊胎和弱仔猪，病情严重甚至造成急性死亡[2-3]； 不同胎龄胎儿均可发生流产。2016年美国多个州猪群证实存在PCV3感染[2,4]，之后韩国、中国、意大利、波兰、巴西等国家陆续报道发现该病毒[5-8]。我国分别在广东、广西、海南、江西、福建、湖南、江苏、河南、山东、贵州、辽宁等某些发生繁殖障碍母猪以及急性死亡仔猪体内检测出PCV3[3,9-11]。截至目前，我国已有多省展开对PCV3的流行病学调查[9-13]，而关于河北省PCV3的分子流行病学调查以及遗传变异分析未见有报道。

PCV3病毒粒子呈二十面体结构，无囊膜，基因组为单股DNA，全长2 000 bp，包含3个主要开放阅读框 (ORF)，分别编码Rep蛋白、Cap蛋白和未知功能的ORF3[14]。其中，ORF2编码的Cap蛋白由214个氨基酸组成，并且Cap蛋白是PCV3的主要结构蛋白和抗原蛋白，诱导机体产生特异性免疫应答。本试验基于PCV3Cap基因对河北省2014-2018年PCV3展开分子流行病学调查，并参考国内外已发表的多个基因序列绘制遗传进化树，分析PCV3的遗传变异趋势，为进一步对PCV3的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 样品采集自2014-2018年河北省不同地区共209份猪新鲜脾脏、肾和淋巴结等，置于-80 ℃保存，本试验所用毒株见表1。

表1 本试验中所用到毒株信息Table 1 Information about strains in this test

1.2 主要试剂 病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、2×TaqPCR Master Mix、MarkerⅢ，均购自天根生化科技(北京)有限公司；pMDTM19-T vector，购自TaKaRa公司；Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 引物的设计 根据文献[3]合成完整的扩增PCV3Cap基因的上、下游引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体序列见表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4 病毒总DNA的提取 将研磨好的组织病料离心，取上清液200 μL，按照病毒基因组DNA提取试剂盒操作说明书进行核酸提取，最后用50 μL DNase/RNase-Free Water 溶解，于-20 ℃储存备用。

1.5 样品PCV3的PCR检测 将样品提取的DNA进行PCR，PCV3反应体系为：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，PCV3-F/R(20 μmol/L)0.5 μL，DNA 5 μL，H2O 6.5 μL。PCV3 PCR扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸40 s，32个循环；72 ℃延伸10 min。

1.6Cap基因的克隆及序列分析 回收Cap基因的目的片段并连接pMDTM19-T载体，转化Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞，进行菌液PCR鉴定。将鉴定阳性的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。利用Lasergene软件中MegAlign进行核苷酸和氨基酸序列分析，使用Mega6.0 软件构建遗传进化树。

2 结果

2.1 2014-2018年河北省PCV3感染情况 对209份疑似发病样本进行PCR检测，结果显示，41份病料为PCV3 核酸阳性，阳性率为19.61%(41/209)。

2.2Cap基因的扩增及克隆 选9份PCV3阳性样本进行PCR扩增，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，回收目的片段分别克隆到pMDTM19-T中，将含重组质粒的阳性菌液分别测序并经BLAST比对。结果表明，扩增得到的片段为PCV3Cap基因，上传GenBank数据库，序列号见表1。

图1 PCR扩增部分阳性样品Cap基因结果Fig. 1 RCR results about Cap gene of part of positive samplesM: MarkerⅡ; 1～4:部分阳性样品M: MarkerⅡ; 1～4:Part of positive samples

2.3Cap基因氨基酸序列分析 经序列测定，Cap基因总长度为645 bp，编码214个氨基酸。通过MegAlign软件分析比对，结果显示，河北省9株PCV3Cap基因序列之间核苷酸同源性为 97.5%～99.5%，编码氨基酸的同源性为93.5%～98.6%。与国内分离株Cap基因氨基酸的同源性为93.5%～99.5%，与国外分离株PCV3-US/MO2015、PCV3-US/MN2016、PCV3-US/SD2016、PCV3-KS/21960、PCV3-BR/RS/6、PCV3-BR/RS/8的同源性为94.4%～99.1%(见图2)。

河北省9株PCV3Cap基因氨基酸与国内外分离株相比，PCV3/CH/HB/HD/2017毒株在第23位由L突变为F，PCV3/CH/HB/CD/2018毒株第91位R突变为W；PCV3/CN/Hebei-1409/2014 毒株第118位L突变为P，第131位 L为突变F，PCV3/CN/Hebei-1613/2016 毒株第116 位C突变为G；第118位L突变为P；PCV3/CN/Hebei-1607/2016毒株第193 位 I突变为K；PCV3/CN/Hebei-388/2015毒株第 157位G突变为L；PCV3/CN/Hebei-1407/2014第206 位S突变为F。

2.4Cap基因序列进化树分析 选取9个毒株与国内外已发表的PCV3Cap基因序列进行比较，并建立遗传进化树(图3)。结果显示，获得的9个毒株处于不同的进化分支上，其中PCV3/CN/Hebei-1407/2014、PCV3/CN/Hebei-1709/2017、PCV3/CH/HB-CD/2018三个毒株与美国PCV3-US/MO2015、PCV3-KS-29160和巴西PCV3-BR/RS/6处于同一进化分支，属于3b亚群；PCV3/CN/Hebei-1607/2016、PCV3/CN/Hebei-0259/2017、PCV3/CN/Hebei-388/2015、PCV3/CH/HB/HD/2017四个毒株与美国PCV3-US/SD2016和巴西PCV3-BR/RS/8处于同一分支，属于3a亚群；除此之外，还有江西PCV3/CN/Jiangxi-62/2016毒株和山东 PCV3/CN/Jiangxi-62/2016毒株等；PCV3/CN/Hebei-1409/2014、PCV3/CN/Hebei-1613/2014两个毒株与PCV3-CN/FuJian-820-2016处于一个分支，属于3c亚群。

图2 Cap基因编码氨基酸序列分析Fig. 2 Sequence analysis of Cap gene amino acid

图3 Cap基因遗传进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of Cap gene

3 讨论

自2016年美国首次检出PCV3以来，我国多个省市相继报道在猪群中存在PCV3感染。从各省调查结果来看，不同省份阳性率大致为12.5%～44.63%，分别为福建12.5%[12]、河南30.26%[15]、华南地区猪场44.63%[8]。本试验中，河北的阳性率为19.61%。PCV2感染可造成机体免疫力减低和其他病毒的继发感染[16]。对PCV3阳性样品进一步进行PCV2检测，结果显示，PCV2阳性率为92.68%(38/41)。PCV3与PCV2感染之间的关系是下一步研究的一个重要方向。

Cap基因遗传进化树分析发现，9个毒株分别位于3a、3b亚群和3c亚群，说明2014-2018年河北省PCV3存在3个亚群，且不同亚群区分与年份和地域相关性不大，呈多样化趋势。从全国多省的分子流行病学调查数据分析，PCV3主要还是以3a和3b亚型为主要流行趋势，个别省份有3c亚群出现。不同亚群间是否存在致病力的差异还有待研究。

Cap基因编码病毒主要结构蛋白和抗原蛋白，是PCV3分子流行病学调查的最佳基因。本试验获得的9个分离株，与国内外分离株氨基酸的同源性为 93.5%～99.5%，Cap基因编码氨基酸在不同部位均有1～3个位点的突变，这些位点的突变是否会引起该蛋白和抗原表位发生变异，这些将作为以后临床研究的对象。此次通过PCV3基因序列比对，发现河北省自2014年猪群中即存在PCV3的感染，因此要时刻加强对进口种猪及肉制品的检验检疫工作，从源头控制新型或未知病毒的传入。本试验将为河北省PCV3的监测、流行和防控补充可靠的数据。