鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白VP1在大肠杆菌中的可溶性表达

黄 英， 付 磊， 靳泽华， 易辰阳， 王晓萍， 张安定,3

(1. 华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室， 湖北武汉430070 ； 2. 湖北省预防兽医学重点实验室 生猪健康养殖协同创新中心， 湖北武汉430070 ； 3. 农业农村部兽用诊断制剂创制重点实验室 科技部动物疾病防控国际联合研究中心， 湖北武汉430070)

鸡传染性贫血病是由鸡传染性贫血病毒(Chicken infections anemia virus,CIAV)引起的一种鸡的病毒性疾病，以再生障碍性贫血和淋巴组织萎缩为主要特征。该病在世界范围内广泛存在，具有很高的流行率，已给养鸡业带来很大的经济损失[1-3]。VP1蛋白是CIAV的衣壳蛋白和免疫原蛋白，有研究表明，VP1蛋白能够诱导宿主产生中和抗体，因此,在亚单位疫苗的开发和快速诊断试剂盒的研制中，VP1蛋白被作为免疫原[4-7]。由于该病毒培养时的增殖滴度不够高，很难满足开发灭活疫苗的需求，目前只有国外的弱毒疫苗可用于该病的防控。为此，本试验对CIAV VP1蛋白的C端进行大肠杆菌表达，同时探讨利用伴侣蛋白实现VP1 C 端蛋白的可溶性表达，为CIAV新型亚单位疫苗的研制和诊断试剂的研发提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 截短的VP1基因(80～449aa)，由天一辉远生物科技(武汉)有限公司进行大肠杆菌密码子优化后合成；pET-28a质粒、分子伴侣质粒、大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α菌株，均由本实验室保存；临床CIAV阳性血清和CIAV阴性血清，均经过商品化试剂盒(IDEXX 公司)检测证实。

1.2 主要试剂 PrimeSTAR HS Polymerase、T4 DNA 连接酶、NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶，均购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自美基生物科技有限公司；质粒小提试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；Ni2+亲和层析柱，购自GE Healthcare公司；HRP标记的山羊抗鸡IgG、HRP标记的山羊抗鼠IgG、His标签的鼠源抗体，均购自Southern Biotech 公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的设计与合成 根据VP1的全基因合成序列，用Primer Premier 5.0 软件设计扩增VP1基因的特异性引物，上游引物为5′-AAACCATGGAAGGTCTGATTCTGCCGAAA-3′(下划线为NcoⅠ 酶切位点，并加上3个保护性碱基)，下游引物为5′-AAACTCGAGCGGCTGGGTACCCCAGTACATG-3′(下划线为XhoⅠ 酶切位点，并加上3个保护性碱基)。

1.3.2 目的基因的PCR扩增 以合成的VP1基因片段为模板，用PrimeSTAR HS Polymerase 扩增VP1片段，PCR扩增的体系为(50 μL总体积)：质粒模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×GC Buffer 25 μL，dNTP Mix 4 μL，Enzyme 1 μL，ddH2O 17 μL。PCR扩增的程序为：98 ℃ 10 s，59 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，共32个循环。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，对正确条带进行胶回收。

1.3.3 目的片段和载体的双酶切 用NcoⅠ 和XhoⅠ限制性内切酶分别对胶回收后的产物和载体质粒(pET-28a)进行双酶切，酶切后产物经1%琼脂糖凝胶电泳，将正确条带回收，用T4 DNA 连接酶将VP1基因克隆至原核表达载体pET-28a。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，涂布于含有Kan+的平板上筛选阳性重组质粒，对提取的质粒进行双酶切鉴定，鉴定正确后送北京奥科生物技术有限责任公司测序，将其命名为pET-28a-VP1。

1.3.4 重组VP1蛋白的诱导表达 将测序正确的阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，挑取平板上的单克隆过夜复苏。次日将菌液接种于含有Kan+的5 mL LB培养基中，37 ℃培养菌至OD600 nm约为 0.6 时，加入IPTG诱导表达，之后进行超声破碎。破碎后制样，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染液染色，8～10 h后使用脱色液脱色，图片用凝胶成像仪拍照留存，pET-28a-VP1质粒和伴侣质粒共诱导表达的试验操作与上述过程相似，只是在接菌时需要额外加入Cm+抗生素，并且在转接菌液时加入伴侣分子的诱导物(0.5 mg/mL L-araB)。

1.3.5 诱导条件的优化 比较不同的 IPTG浓度(0.08 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L)和不同的诱导温度(37 ℃、28 ℃、16 ℃)，对VP1蛋白可溶性表达的影响。样品经SDS-PAGE电泳检测。

1.3.6 重组VP1蛋白的纯化 按照最优的诱导表达条件，重新诱导一批1 L菌液，集菌后，用PBS洗1次菌体。去掉上清后菌体用His binding Buffer重悬，压力破碎仪破碎菌体，然后12 000 r/min离心30 min， 收集上清，使用AKTA蛋白纯化仪进行VP1蛋白的亲和层析纯化，操作方法按照《AKTA蛋白纯化仪操作手册》进行。

1.3.7 重组VP1蛋白的Western Blot 对纯化的蛋白进行Western Blot鉴定，将凝胶电泳后的蛋白样品转至NC膜上，然后用2% BSA+4%脱脂奶粉封闭1～2 h，加入鼠源抗His标签的单克隆抗体(1∶2 000 稀释)，4 ℃过夜，用TBST洗涤3次后加入HRP标记的山羊抗鼠二抗(1∶5 000稀释)，室温摇床上孵育1 h，TBST洗涤3次后用ECL显色。

1.3.8 重组VP1蛋白的免疫反应性 用重组表达纯化的VP1蛋白(2 μg/mL)包被ELISA板，封闭好后，分别加入临床阳性鸡血清和阴性鸡血清，37 ℃孵育1 h，洗涤后加入HRP标记的山羊抗鸡二抗(1∶10 000稀释)，放在37 ℃孵育30 min，洗涤后加入底物显色液(避光)静置15 min，加入终止液后读取OD450 nm值。同时，用Western Blot方法来检测纯化样品与临床阳性鸡血清和阴性鸡血清的免疫反应性。

2 结果

2.1VP1基因的扩增和鉴定 以合成的VP1基因(80～449aa)序列为模板，扩增出1 131 bp的条带，与预期大小一致(如图1所示)。将目的片段与pET-28a载体连接，双酶切鉴定阳性的质粒送公司测序，结果显示，试验成功构建出重组pET-28a-VP1质粒。

图1 PCR 扩增VP1基因Fig.1 Amplification for VP1 gene by PCRM: DNA相对分子质粒标准; 1: VP1基因的扩增M: DNA molecular weight marker; 1:Amplification for VP1 gene by PCR

2.2 重组VP1蛋白的表达验证 pET-28a-VP1重组质粒单独诱导表达的VP1蛋白以及加入分子伴侣质粒后共诱导表达的VP1蛋白分别经过10% SDS-PAGE胶电泳分析，在35～40 kDa均有明显的条带，这与预测的重组VP1大小一致(如图2所示)。与没有加入分子伴侣质粒诱导的VP1蛋白相比，加入分子伴侣质粒后诱导VP1蛋白的上清表达量明显增多。说明试验成功表达重组VP1蛋白，且分子伴侣蛋白能够明显提高重组VP1蛋白上清的表达量。

图2 重组VP1蛋白的表达鉴定Fig.2 Identification of recombinant VP1 protein expressionM:蛋白质相对分子质量标准; 1:空载菌的上清; 2:空载菌的沉淀; 3:不加IPTG诱导的上清; 4:不加IPTG诱导的沉淀; 5:加入IPTG诱导的上清; 6:加入IPTG诱导的沉淀; 7:L-araB和IPTG共诱导的上清; 8:L-araB和IPTG共诱导的沉淀M:Protein molecular weight marker; 1:The supernatant of empty bacteria; 2:The precipitation of empty bacteria; 3: The supernatant of non-induced r-VP1; 4: The precipitation of non-induced r-VP1; 5:The supernatant of IPTG-induced r-VP1; 6:The precipitation of IPTG-induced r-VP1; 7:The supernatant with L-araB and IPTG co-induced r-VP1; 8:The precipitation with L-araB and IPTG co-induced r-VP1

2.3 重组VP1蛋白与伴侣蛋白共诱导表达条件的优化 SDS-PAGE结果显示，在16 ℃ 条件下VP1蛋白上清的表达量优于37 ℃和28 ℃，在最佳温度条件下，当IPTG的浓度是0.08 mmol/L时，VP1蛋白的上清表达量最高(如图3所示)。

图3 重组VP1蛋白与伴侣蛋白共诱导表达条件的优化Fig.3 Optimization of induction conditions for co-expression of recombinant VP1 protein and chaperone proteinM:蛋白质相当分子质量标准; 1～2:空载菌的上清和沉淀; 3～4:0.08 mmol/L IPTG诱导的上清和沉淀; 5～6:0.4 mmol/L IPTG诱导的上清和沉淀; 7～8:0.8 mmol/L IPTG诱导的上清和沉淀M:Protein molecular weight marker; 1～2:The supernatant and the precipitation of empty bacteria; 3～4:The supernatant and the precipitation in 0.08 mmol/L IPTG; 5～6:The supernatant and the precipitation in 0.4 mmol/L IPTG; 7～8:The supernatant and the precipitation in 0.8 mmol/L IPTG

2.4 重组VP1蛋白的Ni2+纯化 如图4A所示，纯化后的样品在35～40 kDa处出现明显的条带，与预测的VP1蛋白大小一致，且蛋白纯度较高。

2.5 重组VP1蛋白的Western Blot 如图4B所示，纯化的蛋白经Western Blot鉴定，结果显示，在35～40 kDa处检测到条带，与预测的VP1蛋白大小一致，与预期结果相符。

图4 重组VP1蛋白的纯化和鉴定Fig.4 Purification and identification of recombinant VP1 proteinA:考马斯亮蓝染色图; B:Western Blot; M:蛋白质相当分子质量标准; 1～2:纯化的样品A:Coomassie brilliant blue staining; B:Western Blot; M:Protein molecular weight marker; 1～2: Purified samples

2.6 重组VP1蛋白的免疫反应性 应用间接ELISA方法检测纯化的重组VP1蛋白与CIAV阳性血清和阴性血清的反应性。结果如图5所示，CIAV阳性血清的读值明显高于CIAV阴性血清的读值(P<0.001)， 说明重组的VP1蛋白能够与CIAV阳性血清发生特异性结合，而不与CIAV阴性血清结合，但是在Western Blot 试验中，CIAV的阳性血清并不能很好地与变性的VP1蛋白发生反应，也间接说明了CIAV阳性鸡血清中的抗VP1蛋白的抗体主要针对的是VP1蛋白的构象表位。

3 讨论

VP1蛋白是CIAV唯一的衣壳蛋白，它在刺激机体产生免疫反应的过程中扮演着重要的角色，同时在CIAV抗原、抗体检测方面也意义重大。VP1基因的N端富含精氨酸，具备很多正电荷，较难在大肠杆菌中高效表达。为了解决这个问题，有许多学者通过直接删除N端富含精氨酸的结构[8]，并根据大肠杆菌偏好的密码子进行优化[9]，实现了VP1蛋白的高量表达，但是可溶性的重组蛋白量很低，难以进一步应用。虽然同时表达VP1和VP2蛋白可以实现VP1蛋白的可溶性表达[10]，但也存在可溶性VP1蛋白含量偏低的问题。有研究指出，伴侣蛋白能够帮助蛋白质正确折叠，从而增加蛋白质的可溶性表达[11]。本研究最开始对N端截短的VP1基因进行大肠杆菌密码子优化和原核表达，且表达产物主要为包涵体，这与Lee M S等的研究结果一致[9]，后面尝试利用分子伴侣提高CIAV VP1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，结果表明，试验成功利用分子伴侣使重组的VP1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达增加，且可溶性表达的VP1蛋白经过Ni2+纯化后，其纯度较高，同时应用间接ELISA的方法初步证明表达的重组VP1蛋白具有一定的反应原性，为CIAV的诊断试剂和新型亚单位疫苗的研制提供了科学依据。

图5 间接ELISA分析重组VP1蛋白的免疫反应性Fig.5 Immunoreactivity of the recombinant VP1 protein by indirect ELISA***:P<0.001， 表示有极其显著的统计学差异***：P<0.001, showing a very significant statistical difference1～4: 4组CIAV感染鸡的阳性血清； 5: 阴性对照血清1～4: Four groups of CIAV-infected positive chicken samples; 5: Negative serum