XPO4基因对人肝癌细胞抑制作用的研究

吴 楠 刘 侃 王晓梅

1.深圳市南山区疾病预防控制中心疾病预防科，广东深圳 518054；2.深圳大学医学部肿瘤研究所，广东深圳 518000

肝癌是全球高发的肿瘤之一，恶性程度高，预后生存期短，致死率高[1]。抑癌基因失活是肝癌发生发展机制中重要的遗传学基础[2]。2008年科学家应用特异性高的RNAi 筛选方法[3]，得到了12个新的抑癌基因，XPO4 就是其中一种。XPO4是细胞核转运因子家族成员，可调节Smad3[转化生长因子-β（TGF-β）信号传导中的组分]和Eif5a（两个密切相关的翻译起始因子）[4-6]。XPO4 在细胞中的去除会引起细胞癌变的概率增加[7-8]。有研究表明，肝癌中XPO4 的表达降低与肿瘤大小及病理分级相关，XPO4 的缺失提示预后差，且可以作为一个独立的危险因子[9-10]，目前利用XPO4基因开展肿瘤治疗研究的报道较少。本研究构建表达XPO4基因的载体，研究XPO4基因对肿瘤细胞的抑制作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

真核表达质粒pcDNA3.1 购自Invitrogen公司；携XPO4基因质粒pCR4-TOPO-XPO4 购自Invitrogen公司；人肝癌细胞株SK-Hep1（XPO4基因完全缺失）由香港中文大学胡宝光博士惠赠；大肠埃希菌菌株DH5a 由深圳大学医学部肿瘤研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1-XPO4 载体的构建 XPO4基因上游引物：5′-GGGGGTACCATGGTCAATAATGAACAA-3′；下游引物：5′-GGGGATATCTTATTTTACACAAAGGAG-3′。以pCR4-TOPO-XPO4 为模板，PCR 扩增XPO4基因。酶切pcDNA3.1 质粒和目的基因XPO4，16℃连接过夜（试剂盒购自Takara公司）。转化大肠埃希菌DH5a，无内毒素质粒提取（试剂盒购自OMEGA公司）。

1.2.2 细胞体外转染 将SK-Hep1 细胞接种至6 孔板，每孔2 mL，细胞密度为2×105个/mL，12 h后进行质粒转染，pcDNA3.1-XPO4 质粒转染SK-Hep1 细胞，按 照Lipofectamine3000 转染试剂（Invitrogen公司）的说明书进行。

1.2.3 蛋白表达检测 按照Western Blot 实验方法，主要试剂XPO4 一抗（Thermo公司）；β-actin 一抗（北京博奥森公司）；羊抗兔二抗（武汉博士德公司）。

1.2.4 XPO4基因体外抑瘤实验 以SK-Hep1 细胞接种于96 孔培养板中，每孔100 μL，细胞密度为2×104个/mL。12 h后进行质粒转染，采用CCK-8 检测细胞存活率。将SK-Hep1 细胞接种至6 孔板，每孔2 mL，细胞密度为2×105个/mL，12 h后进行质粒转染，采用Annexin V-FITC/PI 检测细胞凋亡。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用T检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 XPO4基因PCR 产物鉴定

用1%琼脂糖凝胶电泳检测XPO4 的PCR 产物，在3000～4000 bp 有一条带，大小与预期相符（图1）。

2.2 重组载体的酶切鉴定

用KpnⅠ和EcorⅤ双酶切pcDNA3.1-XPO4，对照质粒为pcDNA3.1，XPO4基因正确插入pcDNA3.1载体中（图2）。

2.3 pcDNA3.1-XPO4 转染后XPO4 蛋白表达

图1 XPO4 的PCR 扩增图

图2 pcDNA3.1-XPO4 质粒酶切图

在重组质粒pcDNA3.1-XPO4 转染组中，有XPO4蛋白表达，在SK-Hep1 细胞对照组和pcDNA3.1 空质粒转染组中，没有XPO4 蛋白表达（图3）。

图3 Western BloT检测XPO4 蛋白表达

2.4 pcDNA3.1-XPO4 体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用

重组质粒pcDNA3.1-XPO4 转染组的细胞存活率低于SK-Hep1 细胞对照组和pcDNA3.1 空质粒转染组，差异有统计学意义（P<0.001）。SK-Hep1 细胞对照组的细胞存活率与pcDNA3.1 空质粒转染组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图4）。2.5 pcDNA3.1-XPO4 体外对肿瘤细胞凋亡的作用

图4 CCK-8 检测SK-Hep1 细胞增殖

重组质粒pcDNA3.1-XPO4 转染组细胞的早期凋亡率[（13.89±1.62）%]高于SK-Hep1 细胞对照组[（5.14±1.13）%]和pcDNA3.1 空质粒转染组[（5.79±2.11）%]，差异有统计学意义（P<0.001）。SK-Hep1 细胞对照组细胞的早期凋亡率与pcDNA3.1 空质粒转染组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图5）。

3 讨论

图5 Annexin V-FITC/PI 检测XPO4 表达对SK-Hep1 细胞凋亡的影响

肝癌发病机制复杂，常与相关基因的突变或积累有关。基因治疗已成为癌症治疗的重要研究领域，因此，寻找高效的抑癌基因是肿瘤治疗进一步发展的重要方向。近年来研究发现，真核细胞的细胞核与细胞质之间存在物质交换，细胞核向细胞质输出许多种类的大分子。出核转运通过核孔复合物（NPC）通道和选择性转运蛋白，同时也依赖核输出信号结合受体，如XPO4[4]。XPO4 也称为Exportin 4，可能是一种重要的抑癌基因。本研究探讨XPO4 在人肝癌细胞株SKHep1 中的表达对该肿瘤细胞生长增值的影响，结果显示，pcDNA3.1-XPO4 质粒转染至SK-Hep1 肝癌细胞中，XPO4 在SK-Hep1 中表达。表达的XPO4可以抑制SK-Hep1 细胞的生长增殖和诱导凋亡。XPO4 抑制肿瘤的机制可能是通过调节Eif5a 和Smad3 蛋白水平来进行[11]。细胞中XPO4 缺失，影响Smad3 出核，而Smad3 蛋白是TGF-β 的配体，细胞核Smad3 的增加，伴随TGF-β基因上调，这种影响很好地解释了当XPO4基因缺失导致TGF-β信号通路的紊乱，使细胞逃逸TGF-β 介导的生长抑制效应，导致多种肿瘤发生[5，12-13]。近年来的研究发现，Eif5a 在人癌细胞中总体上来说是过度表达的，肿瘤的恶性程度尤其是肿瘤的恶性增值能力、转移能力与肿瘤细胞内表达的Eif5a密切相关，如果细胞内缺乏XPO4 则有助于Eif5a 的出核，通过XPO4-Eif5a 这一信号通路刺激肿瘤细胞增殖[14-16]。

为了揭示XPO4 对肿瘤细胞的影响，本研究制备了携带表达XPO4基因的pcDNA3.1-XPO4 质粒载体，选择肝癌细胞SK-Hep1 进行实验。SK-Hep1 细胞系中缺失XPO4基因，通过转染SK-Hep1，引起XPO4在细胞中表达。CCK-8 检测细胞增殖显示，重组质粒pcDNA3.1-XPO4 转染组的细胞存活率低于SK-Hep1细胞对照组和pcDNA3.1 空质粒转染组，差异有统计学意义（P<0.001），提示XPO4基因表达能抑制肿瘤细胞生长。重组质粒pcDNA3.1-XPO4 转染组细胞的早期凋亡率高于SK-Hep1 细胞对照组和pcDNA3.1空质粒转染组，差异有统计学意义（P<0.001），提示XPO4基因表达对肿瘤细胞有杀伤作用。SK-Hep1 细胞对照组的细胞存活率和早期凋亡率和pcDNA3.1空质粒转染组比较，差异无统计学意义（P>0.05），提示XPO4基因可能参与并发挥重要的抑制肿瘤进程的作用。

Liang 等[10]通过对临床肝癌手术患者的病理检测，发现XPO4 在癌旁组织中的表达，高于肿瘤组织，且肿瘤越大表达量越低，提示XPO4可能参与肿瘤进程。Zender 等[11]将肝癌易感小鼠模型和RNAi 技术结合，在小鼠模型中将XPO4 沉默后可引起肿瘤，因此也进一步获得XPO4 作为抑癌基因的证据。

综上所述，肝癌细胞系SK-Hep1 模型不表达XPO4，而通过构建的重组质粒载体转染，可以在肝癌细胞成功表达XPO4基因，有效抑制肿瘤细胞的增殖和诱导凋亡。因此XPO4基因作为抑癌基因对肿瘤治疗具有极大的潜力，增强XPO4基因的表达可以为临床治疗肝癌提供参考依据。同时仍需深入研究肝癌的发生机制[17-18]，更好地了解XPO4基因抑癌的原因，为疾病的诊断与治疗提供新的方向。