实验性大鼠缺血再灌注损伤与细胞凋亡时序性表达研究

2021-01-06刘晓杰王东明

世界最新医学信息文摘 2021年15期

刘晓杰，王东明

（吉林市中心医院，吉林吉林 132011）

0 引言

短暂性局灶性脑缺血后神经细胞死亡机制复杂，但这种损伤背后的细胞死亡式还没有得到很好的描述。至少有两种细胞死亡形式：坏死和凋亡参与了这一过程，尽管也有人认为缺血性神经元死亡是通过一种新的途径发生的，该途径具有坏死和凋亡的某些特征[1]。这一争议可能部分是由于用于研究缺血性脑损伤的方法不同所致。脑缺血后的炎症反应包括外周血白细胞从循环到脑内的浸润以及促炎细胞因子的上调。细胞因子IL-1b、TNFa 和IL-6 的表达高峰在局灶性缺血后12～24h。最近的证据表明，这些细胞因子中的每一种都可能导致中风后神经元损伤的加剧。卒中患者外周循环中IL-6 水平升高与卒中严重程度、患者的功能恢复有关[2]。在动物模型中，多形核白细胞在局灶性缺血后6-12h 内与脑毛细血管黏附，随后白细胞向脑组织迁移，最近在小鼠缺血模型中观察到这一现象。我们应用多种定量和定性技术，探讨大鼠局灶性脑缺血后神经细胞的损伤模式[3]。

1 随时间变化细胞凋亡情况

流式细胞仪检测脑细胞核DNA 裂解及凋亡小体形成情况，细胞凋亡特征为二倍体核样峰(AP 峰)。根据AP 峰所占比例，可对细胞凋亡进行定量分析。

局灶性脑缺血区细胞凋亡，但细胞坏死结构改变。细胞凋亡与坏死并存。通过光镜和电镜的病理形态学观察，可以很好地区分凋亡和坏死。但核心区和半影区的分布明显不同。大体上，局灶性脑缺血所致的脑损伤由严重梗死核心区和低灌注外周区组成[4,5]。随着缺血时间的延长，缺血核心区脑组织发生坏死，而缺血环境相对较轻。因此，如果及时采取治疗措施，可能会挽救缺血脑组织的周围环境。否则，这些外围区域可能会形成新的坏死区[6]。近年来，随着细胞凋亡研究的深入，有学者[7]认为无论是脑缺血后的脑组织损伤还是缺血后的再灌注损伤都与细胞凋亡密切相关。

最近有研究采用健康雄性成年昆明小鼠70 只，六七周龄，体质量20～22 g，将大鼠分为对照组和缺血再灌注组，再分为假手术组建立了大鼠局灶性脑缺血(MCAO)再灌注模型。通过大脑近端外动脉插入细丝，阻断大脑中动脉的起始部。抽出细丝，再次建立循环。短暂阻断2 血流小时。流式细胞仪(FCM）检测海马区神经细胞凋亡百分率[8]，随着缺血再灌注时间的延长，缺血中心区和半影区脑细胞DNA 裂解百分率均明显增加。缺血2 小时再灌注24 小时后，缺血核心区和半影区DNA 裂解百分率均明显升高，缺血再灌注24 小时后缺血区DNA 裂解百分率明显高于2 小时(P＜0.01)，糖尿病组缺血再灌注24 小时再灌注24 小时后缺血区DNA 裂解百分率较前升高不明显(P＜0.01)。脑组织有明显的损伤倾向。提示损再灌注明显加重缺血半影区细胞凋亡，加速缺血核心区神经元坏死由半影区向中线扩展的过程[9]。

2 随时间变化细胞因子水平变化

需要小鼠模型来阐明中风时导致神经元损伤的具体机制。几种细胞因子已经被报道在脑缺血大鼠模型中受到调节；最近利用小鼠大脑中动脉阻塞模型的观察表明，许多细胞因子和生长因子参与了脑缺血后神经元损伤的调节[10]。虽然目前尚不清楚细胞因子表达改变与神经元损伤之间是否存在直接联系，但最近的几项研究支持单个、细胞因子与神经学结果之间存在很强的相关性。TGFb1 似乎在缺血中起到神经保护作用，因为在腹腔注射的小鼠中观察到较小的梗死[11]。此外，TGFb1 可能在缺血半暗带处上调。多项研究提示IL-1 的存在可能加重缺血性损伤。IL-1b 和IL-1ra 的早期上调，此外，我们还显示在短暂性和永久性缺血后IL-1a 水平有轻微的增加。另外，已有研究表明IL-1ra 过表达可减轻小鼠缺血性脑损伤，提示IL-1 系统在脑缺血中起重要作用[12]。

有研究显示了TNFa mRNA 水平的早期明显的增加，然而，TNFa 在化学性脑损伤中的作用尚不清楚。虽然在TNFa受体敲除小鼠中的这一发现暗示了TNFa 的神经保护作用，但应该指出的是，在这些小鼠中，IL-1 可能存在代偿性增加，这可能会加剧缺血的神经元损伤。未损伤的小鼠中枢神经系统未检测到IL-1b、IL-6 和TNFa。中枢神经系统损伤后，这些细胞因子mRNA 的表达明显诱导。数据表明，卒中后中枢神经系统中细胞因子的表达可能受到分层调控[13]。

短暂性脑缺血早期TNFa mRNA 水平升高，随后IL-1bmRNA 水平升高。脑缺血损伤的早期细胞反应可能涉及损伤部位的反应性小胶质细胞。激活的小胶质细胞可以释放多种细胞毒素，如一氧化氮、兴奋性氨基酸和炎性细胞因子IL-1b、TNFa 和IL-6，脑局灶性缺血引起的急性炎症的特点是循环中多形核白细胞的浸润。最近一项研究，用RT-PCR 分析永相对E-选择素mRNA 水平。选择素mRNA 表达的调节增强。对缺血再灌注小鼠缺血半球的RTPCR 分析显示的表达明显增加。E-选择素mRNA 的水平达到峰值为10h。流式细胞仪检测脑细胞核DNA 裂解及凋亡小体形成情况，细胞凋亡特征为二倍体核样峰(AP 峰)。根据AP 峰所占比例，可对细胞凋亡进行定量分析。TNFa 在4h 开始升高，随后IL-6 在10h～18h 升高，TGFb1 水平后期升高，这可能是由于半影区神经元修复过程的激活，半影区是一个神经元存活时间更长的区域，这与该生长因子所具有的神经保护作用相一致。这些细胞因子在18h，细胞因子水平达到峰值[14]。

3 局灶性脑缺血再灌注后不同时间的病理改变

光镜下可见神经元固缩、偏曲，核梭形神经元和少量深染神经元。缺血2 小时恢复血流量时，病变范围随再灌注时间延长而扩大，再灌注24 小时达高峰。可见大量深染的神经元细胞核固缩、偏斜。细胞质具有较强的嗜酸性。基底节区可见轴突肿胀、变性。另一方面，出现神经元坏死和基质肿胀。永久性24 小时缺血组核心大部分细胞结构消失，坏死区出现大量胶质细胞增生[15]。半影区出现固缩，胞核深染，胞浆呈嗜酸性。在相同条件下，糖尿病组脑组织核心坏死范围和半暗带范围明显大于非糖尿病组。电镜下，缺血2h，染色质开始聚集、变块状，分布于核膜周围，核质变得不均匀、固缩。缺血2h 再灌注6～12h 后，上述改变明显加重。粗面内质网明显增生，倾向于沿细胞核呈同心平行的鞭毛排列，核周水肿明显。再灌注24 小时后，线粒体肿胀，线粒体内嵴排列紊乱，形成空泡。更严重的是细胞膜溶解，核膜不完整，核基质消失。结果表明，不仅存在生物多样性的特征性变化，而且还存在一定的生物多样性[16]。