慢性伤口细菌生物膜管理的研究进展

钟果玉 谭惠仪 叶雪梅

慢性伤口也称慢性难愈性创面,目前对于其定义未达成统一的共识，伤口愈合学会对其定义：各种内在或外在因素影响下，无法通过正常、有序、及时的修复过程达到生理解剖和功能上的完整状态的伤口，关于时间的分界为4周未愈合的伤口[1-2]。随着社会人口老龄化，慢性伤口也呈老龄化趋势且数目日益增长，慢性伤口的迁延不愈不仅对患者的身心造成负面影响，还给社会带来医疗经济负担。据统计[2]，带来慢性伤口中细菌生物膜普遍存在，是引起伤口延迟愈合的重要因素。因此认识生物膜、掌握其临床特征、实施针对性的伤口管理，对促进慢性伤口愈合具有重大意义。

1 生物膜定义及概述

生物膜[3]被定义为微生物（细菌和真菌）构成的复杂的、动态的微生物群落，能合成并分泌一种胞外多糖蛋白复合物多聚物( EPS）使包裹的微生物相互粘连并聚集形成膜状物质，不可逆地附着于创面上。 Malone等[4]于2017年结合生物膜体内外证据共性，将其简化定义为：对于治疗和宿主防御具有耐受性的细菌集合。生物膜的形成机制复杂[5]，涉及到伤口表面、微生物和EPS之间复杂而动态的相互作用，使其对抗生素和宿主免疫反应表现出显著的耐受性，延长了伤口愈合时间。

2 早期识别诊断细菌性生物膜

2.1 细菌生物膜临床识别

2.1.1 宏观识别 据大量的临床实践及实验的腐肉相鉴别，根据欧美压疮专家咨询组制定的临床实践指南[3]中提出腐肉一般为黄色、黏稠、柔软不透明的疏松或稳定附着于伤口的物质；创面上的生物膜多为有光泽、凝胶状的物质，除了外观性状的区别，国内外研究[6-7]还总结了两点差异：一方面腐肉与创面基底部组织紧密连接相较细菌生物膜，需锐器彻底清创;另一方面腐肉对酶类或自溶性清创敷料较细菌生物膜敏感。但是凭借主观的判断缺乏客观标准，可信度及准确度不高。

2.1.2 微观检测 由于生物膜的结构微小，难以用肉眼识别，临床利用实验显微技术对伤口采集标本进行分析。虽然伤口组织活检被视为细菌培养的金标准[3]，但是出于操作的侵入性及对人员的技术较高，实践中并不常用。拭子培养最被提倡用于伤口的细菌培养，采用Levines拭子技术其细菌定性培养结果与组织活检的结果基本一致[3]。除了传统的培养方式，目前也采用现代分子生物技术，该技术是指通过对微生物染色体染色并分析其中的DNA序列鉴定微生物种类，如：变性梯度凝胶电泳（DGGE）,肽核酸-荧光原位杂交,聚合酶链反应等[8]。DGGE可分析出伤口微生物的数目,发现细菌培养未检测出的细菌。Steven等[9]成功通过DGGE证明了伤口及周围皮肤部位微生物的多样性。但是因微生物的基因异质性，分子生物技术无法有效地切除微生物DNA条带等局限性，分子生物技术仅仅检测出部分微生物种类的结果。随着生物信息学与计算机技术日新月异发展，这些技术将用于微生物的快速定性和定量分析，提高识别慢性伤口细菌生物膜感染的准确性和科学性，这是未来检测细菌生物膜的新方向。但目前因操作的复杂性及高昂的费用，难以在临床应用与推广。

2.2 细菌生物膜的临床诊断

2017年的国际共识[10]中提出，伤口出现以下5大特征，提示生物膜感染的可能性:创面延迟愈合；创面复发性感染；抗生素、抗菌剂使用无效；伤口大量渗液渗出；伤口有轻度慢性炎症、红肿、红斑。另外Bianchi等[11]认为,检测细菌生物膜的金标准是肽核酸-荧光原位杂交、共聚焦激光扫描显微镜或电子扫描显微镜等可视化技术。 Haesler等[12]认为，通过肉眼观察，伤口表面的深层位置物质，因为低灵敏度尚不认为是生物膜的临床指标。Johani等[13-14]证实，细菌生物膜经常存在于伤口的深部组织（平均50~70μm）表面且以厌氧菌为主，肉眼难以精确识别导致忽视对其处理干预，这也是慢性伤口延迟愈合或不愈合的重要因素。通常伤口出现生物膜感染特征之一时，建议在严格无菌操作条件下进行组织活检或细菌培养，接着结合激光扫描共聚焦显微技术，观察包裹在细菌表面的胞外多糖物质，这是诊断细菌生物膜存在的重要阳性指征［9-10］。生物膜的临床诊断工具是慢性伤口实施有效管理策略的最大障碍，但是目前未在细菌生物膜的临床识别、诊断的金标准方面达成共识。

3 细菌生物膜的创面管理

3.1 基本伤口管理原则

慢性伤口生物膜的微生物多样性，生物膜表型其耐药性[15]是浮游细菌的10~1000倍，因此采用多种并行干预策略显得尤为重要。根据一项全球调查[16]，在生物膜管理共识中提出，针对慢性伤口患者的整体护理和创面管理：在管理伤口生物膜感染时，常忽略患者抗感染能力下降的相关因素，应关注组织血氧供应、营养、血糖水平和水肿等整体情况；创面管理需考虑创面床的准备情况，包括清创、创面清洁、创面抗菌药物管理和创面湿性平衡。

3.2 伤口床的准备

3.2.1 清创术 是一种由外科医生或伤口专科护士操作，去除腐肉、失活和坏死组织、细菌生物膜等，以改善或促进伤口愈合的护理技术[17]。常见的清创方法为机械清创、锐器/外科清创、自溶清创和酶清创。 机械清创指利用机械力去除慢性伤口坏死组织的清创方法，最常见包括湿到干的敷料，水疗（涡流）和伤口灌洗（脉冲式灌洗）等[3,17]。但是目前缺乏研究[18-19]证实机械清创能去除生物膜，所以临床应用也逐渐减少。 Swanson等[16]提出在合理安全的情况下，外科和锐器清创是清除失活组织及生物膜的金标准，同时建议所有类型的伤口进行剧烈的清创（外科/锐器清创），凝血功能障碍及动脉性缺血性的伤口除外。清创将慢性伤口转变为急性加速其愈合，虽然不能彻底清除细菌生物膜，但相对超过24 h成熟的生物膜，在清创24 h内未成熟的生物膜，对局部抗菌剂更加敏感[16]。自溶性清创[20]指利用封闭或半封闭敷料（类型包括透明膜、水凝胶或水胶体等），保持伤口湿润，让自身伤口渗液产生的内源性酶（如蛋白水解酶），去除伤口床的坏死组织。Miller等[21]以伤口凝胶为例，该凝胶通过活性降解EPS破坏生物膜基质，分解定植的细菌，同时提供湿润的愈合环境来清除生物。自溶性清创患者一般无疼痛感，但是禁用于严重感染的伤口。在清除细菌生物膜的安全性、有效性方面，相比外科/锐器清创术，其他类型清创术缺乏高等级的证据支持，对此期待我国更多的学者开展相关量性研究，随机对照试验。

3.2.2 创面的清洁 指从伤口表面清除未黏附的炎性污染物，是促进伤口愈合、减少生物膜发展及成熟的必需过程。若仅仅清洗伤口表面，伤口无潜在的感染物，可以应用清水或等渗生理盐水，但是生理盐水对清除生物膜无效[3,22]。PerciVal等[22]证实，以浓缩的泊洛沙姆为基础的表面活性剂，通过降低伤口床和清洁液之间的表面张力、化学极性，以破坏微生物黏附、去除伤口污染物，在生物膜管理中起着重要作用。Bellingeri等[23]的回顾性分析中，表面活性剂冲洗液为实验组，相比对照组（林格液或生理盐水），在下肢静脉溃疡愈合率的影响中，结果显示，表面活性剂的愈合率高达97%。临床应用伤口清洁剂时，必须权衡其对细胞的潜在毒性，由于缺乏检测伤口清洁剂的标准方法，及表面活性剂分解细菌生物膜EPS能力的证据，因此目前难以阐明伤口清洗剂的安全性。

3.2.3 负压创面疗法（NPWT） 通过充分引流伤口渗液改变创面pH,温度和湿度等微环境，有效去除细菌生物膜和控制感染[24]。早期应用NPWT可以预防生物膜形成，达到改善伤口的目的[25]。Topaz等[26]首次报道，NPWT结合局部氧疗（TOT）简称NPWTO2新方法，利用-120 ~-150 mmHg（－15.99~－16.67kPa）的负压值，2~3 L/min氧流量输入伤口，治疗厌氧菌获得成功。蒋琪霞等[24]在32例慢性伤口观察组中应用负压创面疗法(负压值为-120 mmHg)与局部氧疗（氧流量为3 L/min）的干预方式，3个月内治愈率为87.5%，得出NPWTO2在伤口中应用可以控制感染、清除生物膜、改善创面微环境，进而缩短伤口愈合时间。但是有研究[26]提出,NPWT在慢性伤口的局部可形成低氧环境，容易继发厌氧菌感染，影响伤口愈合。

3.2.4 创面敷料的使用 敷料的选择应基于标准的临床参数而不是敷料的含银量或释放活性。①单一敷料：含银敷料目前认为具有广谱抗微生物的作用；含银离子（5~10 mg/L）敷料[27]24 h内可以清除约90%的伤口生物膜，48 h内可完全去除；其局限性为银离子可能对宿主细胞具有严重的细胞毒性作用以及潜在的副作用，皮肤良性但永久性蓝灰色变色[28]。一项体外试验[29]中应用1%磺胺嘧啶银4 h的人成纤维细胞存活率仅18%，该结果证明其对皮肤创面的毒性作用。②多元性敷料：NGAD(next-generation antimicrobial dressig) 一种新型抗菌敷料液体伤口敷料由抗菌剂与表面活性剂组成，Walker等[30]通过非随机对照试验中评估113名患者,其中74%的患者怀疑有生物膜，NGAD平均干预4周后,伤口改善率为94.7%（107例）。不足之处，目前还缺乏建立针对含银及其他创面敷料安全性、有效性的体内模型或研究证据。

3.3 局部抗菌药物的管理

目前无证据支持治疗伤口相关感染时使用全身抗生素能预防生物膜感染[31]。理想的抗菌剂应具有广谱性，迅速持久到达创面床，在渗出液中仍有效的活性，细菌产生耐药性低，无全身吸收。工程蜂蜜是一种公认的伤口护理剂，Oryan等[32]就蜂蜜对伤口愈合的治疗作用进行论述，结合25项临床研究中对不同所有伤口类型（慢性伤口在内）使用不同的蜂蜜，得出了医用蜂蜜促进伤口的愈合，减少了瘢痕的形成。其他抗菌剂：20%冰醋酸、卡地姆碘、胶原酶等。局部抗菌药物的应用减少慢性伤口感染的风险及细菌耐药性[33]。当伤口感染区域扩散到伤口边界涉及骨骼或深层组织及全身时才针对性选择抗生素。目前还缺乏足够的文献和临床研究数据支持抗菌药物在生物膜中的作用及机制，未来医务人员可就此方面进行深入研究，将为日后生物膜的临床治疗带来极大改观。

4 细菌生物膜最新辅助疗法

4.1 纳米材料

近年来，大多数金属基纳米材料，不仅通过活性氧来灭活细菌，而且同时释放具有抗菌活性的纳米粒子，杀灭病原菌，如银纳米颗粒( AgNPs) 。AgNPs作为生物膜靶向剂穿透生物膜并对多种细菌的生物膜治疗有效[34]， 不仅显著抑制和杀死浮游细菌，还有效阻止生物膜的形成，破坏生物膜结构。研究发现[15]，低浓度的AgNPs暴露导致成熟生物膜生长迟缓，高浓度(18ug/ml)AgNPs完全阻止生物膜的形成。Su等[28]在体外试验及动物模型中，利用可生物降解纳米纤维敷料，通过局部传递抗菌肽再结合清创治疗，不仅有效清除慢性创面生物膜，还对组织无明显的细胞毒性作用。随着治疗生物膜材料和纳米技术的发展，使生物膜靶向工程成为可能，其中纳米颗粒提供了具有研究前景的治疗平台，有望减少抗生素的使用和细菌的耐药性。

4.2 间充质干细胞

间充质干细胞( MSCs)是一种存在于骨髓，脂肪组织等多部位可自我更新的多功能细胞，可以通过直接分泌抗菌肽或间接调节宿主免疫反应来达到抗菌和抑制炎症反应作用。目前动物实验[35]中利用MSCs疗法与抗生素相结合的创面生物膜更有效,有望成为治疗慢性伤口感染的有效工具。但是仍需要更多的体内研究，直接测定其对伤口生物膜管理的影响。

4.3 其他辅助干预

噬菌体[36]是一种针对细菌的病毒，作为选择特异性的抗菌剂，联合蜂蜜或清创术在体内外模型中的应用均有效去除生物膜，未来临床应用中可能是一种有效的辅助手段。益生菌、抗生素光动力学及无接触低频超声波等新技术均为细菌生物膜的管理策略提供了新的方向。

5 展望

细菌生物膜在慢性伤口领域的研究日益引起人们广泛关注，如何识别和诊断细菌生物膜，为慢性伤口患者提供有效的、创面管理成为关键，因此通过查阅相关国内外文献总结：目前识别及清除细菌生物膜仍处于探索阶段，染色法和现代显微技术的发展使细菌生物膜的定位与识别成为可能；目前国际上管理细菌生物膜的趋势是两种及以上干预方式的联合应用（如清创+局部抗菌剂、清创+创面敷料等），促进伤口愈合提高患者生存质量。虽然新的抗细菌生物膜技术，在体外模型的应用取得了进展,但是其存在局限性：第一，许多用于慢性伤口管理的伤口治疗决策，特别是细菌生物膜方面，缺乏大量强有力的证据支撑及临床的随机对照验证；第二，对生物膜的研究大多仍局限于体外及动物实验，使用“未成熟生物膜”进行干预，缺乏临床评估及标准的伤口护理，得出的相关性研究结论令人质疑；第三，通过对慢性伤口患者的整体评估与伤口局部评估有机结合，进一步探索适用于慢性伤口患者，清除细菌生物膜的有效性、安全性、经济性的创面干预策略，未来可进行大样本的对照试验和多中心研究，为临床工作者提供证据和推广应用，改善慢性伤口患者结局。