NIPT-plus用于产前检测的现状及发展前景

吴梦诗，罗欣

(重庆医科大学附属第一医院 产科，重庆 400000)

0 引言

胎儿染色体异常(例如染色体非整倍性和染色体节段失衡)在妊娠中很常见，并且通常发生在植入前的胚胎期，由减数分裂分离错误或有丝分裂复制错误引起[1]。通常，它们会导致孕早期胚胎生长停滞，植入失败或早期流产。但是，有1%-1.7%的胎儿仍具有发育能力，如果无法通过产前诊断发现，胎儿则可以持续生长发育到孕中期及孕晚期，它们会受到染色体异常的影响，并在出生时表现为染色体疾病综合征。在1岁之前诊断出的主要先天性异常中，大约15%是由染色体异常引起的，其中25%将导致围产期死亡[2]。对于存活的染色体异常的孩子，也很大可能伴随智力低下，多发性发育不良或畸形。但是，到目前为止，对此尚无有效的治疗措施。因此，在出生前检测染色体疾病则尤为重要。许多国家为未出生的胎儿提供筛查计划(产前检测及诊断)，以识别某些有相关风险的孕妇，帮助其早期诊断和治疗。随着技术的进步同时也刺激了产前筛查计划的发展，最初，常规的唐氏综合征筛查仅在孕中期进行，仅使用甲胎蛋白(AFP)进行筛查，随后扩大到包括全部或游离的β人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)，未结合的三聚雌三醇和二聚抑制素A。到90年代末，使用超声影像学在孕期第三个月(例如颈部半透明层，鼻骨)和生化标志物，游离β-hCG和妊娠相关血浆蛋白A进行产前筛查也逐渐开展[3]。1997年，通过鉴定Y染色体特异性DNA片段，在孕妇血浆和血清样品中首次发现了无细胞胎儿DNA(cffDNA)[4]。发展至今，cffDNA作为一种有前途的分子生物标志物，其发现使产前检测发生了巨大转变，也已被用于产科研究的各个方面，尤其在产前诊断和复杂妊娠中，可以更安全、更早地检测到胎儿的遗传状况。胎儿染色体非整倍性的无创产前检测(NIPT)为孕早期产前筛查提供了另一种高效的方法，并且自发现之日起便在世界范围内迅速采用。随着无创产前检测(NIPT)的广泛采用，许多通过传统筛查方法归为高危或低危妊娠的孕妇也开始选择NIPT，这种选择已经使侵入性诊断的需求降低高达40%[5]。目前商业领域已经扩大了cffDNA筛选的范围，包括性染色体非整倍性，罕见的常染色体非整倍体和亚显微拷贝数变异，且已经以“ NIPTplus”的形式开展检测。

1 cffDNA介绍

在怀孕期间，可以在母体血浆中检测到来自发育中的胎儿的DNA，并将其称为无细胞胎儿DNA(cffDNA)，cffDNA起源于胎盘的滋养层，并由核酸内切酶降解后作为短dsDNA片段释放到母体血中，长度为143bp，因此，cffDNA平均比母体无细胞DNA(cfDNA)短，后者的中位长度为166bp，它来源于身体多种组织细胞的自然裂解，其中大部分来自造血细胞。因此，孕妇血浆中的cfDNA是母体cfDNA和从胎盘释放的无细胞胎儿DNA(cffDNA)的混合物，可用于测试胎儿的遗传状况[6]。通常在妊娠6至7周时可检测到cffDNA，据报道最早的检测是在4～5周时检测到的[7]。cffDNA与总cfDNA的比例称为胎儿分数，在整个怀孕期间都会增加，在妊娠晚期可能高达30%。胎儿分数随母体BMI升高而降低，产妇年龄也与胎儿分数呈负相关[8]。胎儿出生并娩出胎盘后，cffDNA会在数小时内从母体循环中清除。自cffDNA发现以来，其彻底改变了产前基因检测，从而允许开发用于非整倍体的非侵入性筛查方法，称为非侵入性产前检测(NIPT)或非侵入性产前筛查(NIPS)，以及针对单基因疾病的诊断检测，称为非侵入性产前诊断(NIPD)。染色体微阵列分析(CMA)，可检测染色体的亚显微拷贝数变化，被推荐为胎儿的一种或多种先天染色体异常检测的一线测试[9]。而迅速发展的下一代测序(NGS)技术为产前诊断带来了革命性的变化，使全基因组测序更快，更经济。通过比较拷贝数变异，NGS已显示出与CMA相当的准确性，NIPT是NGS技术的一个里程碑，当用于检测母体血液中的无细胞胎儿DNA(cffDNA)时，为21三体性和其他非整倍性的胎儿诊断提供了卓越的准确性[10]。

2 无创产前检测技术目前优点

多项研究已经证实了NIPT的检出率及有效性，先前报道指出NIPT对21三体的敏感性为99.7%，而18三体性为97.9%，13三体性为99.0%[11]。NIPT对13三体和18三体的敏感性较低，是由于这些染色体的鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的平均含量低于21号染色体，这在测序反应中引入了不均匀的偏倚。因此，NIPT相对于孕中期的生化筛查具有相当大的优势，比孕前生化筛查和颈部半透明性测量有更高的特异性和敏感性。而且因为它的假阳性率较低，这也意味着在健康的妊娠中减少了许多不必要的侵入性检查[12]。侵入性产前诊断的并发症包括但不限于流产及感染等，在临床实践中，处于染色体异常高风险的孕妇由于担心上述风险而经常拒绝进行侵入性产前诊断。因此，愿意接受NIPT的高风险孕妇人数也逐渐增加。从终止妊娠的时机上来说，NIPT可以从妊娠第9周开始进行，让获得阳性结果的妇女在数周内就是否终止妊娠能够做出决定。相比之下，羊膜腔穿刺术从第15周开始进行，导致终止妊娠的程序更加复杂，也将给孕妇带来更不利的心理和生理影响。加之侵入性产前诊断的开展需要较高的技术要求和实验室平台，因此该项技术的应用也受到局限[13]。NIPT的开发最初目的主要是检测T21，T18和T13，这是产前筛查和诊断的重点。但是，技术的进步使胎儿其他疾病的检测也成为可能，这对于预防先天缺陷是必不可少的。通过应用与染色体非整倍性分析相同的原理，NIPT也已扩展到检测胎儿基因组内的染色体缺失和重复，即应用NIPT-Plus进行相关产前检测。

3 无创产前检测技术目前局限性

近年来，NIPT因其对T21，T18，T13和某些性染色体疾病具有很高的检测率，已经改变了产前筛查和诊断。但是，尽管其具有高准确性，NIPT也有一些局限性。它对T21，T18和T13的检测具有>90%的灵敏度和较低的假阳性率。对于常见的胎儿非整倍体和性染色体异常(SCA)，其假阳性率分别为0.09%和1%。假阳性病例最常见的是母亲的染色体拷贝数变异(48%)，其次是局限性胎盘镶嵌(32%)和母亲患癌症(15%)[14]。据文献报道，估计约有2%-10%的具有颈部透明性异常的胎儿会被NIPT遗漏，以及一定比例的染色体结构重排，镶嵌，三倍体和基因拷贝数变异。这很可能是由于胎儿cffDNA从母体血浆和MPS扩增而来，导致胎儿和母体DNA混合和部分降解。因此cfDNA测试不能代替早期超声和血清标志物评估，因为这些技术可以识别其他高危胎儿状况，例如无脑儿[15]。羊膜腔穿刺术最常用于中孕期快速核型分析，并被认为是在染色体异常高危妊娠中诊断胎儿染色体异常的金标准。据文献报道，NIPT可能会错过通过羊膜穿刺术和细胞遗传学检测所发现的染色体异常的30.0%。由于NIPT-plus的发展，该比例将来可能会降低。因此，不建议将NIPT作为具有超声软标记或病理超声检查结果的妊娠的染色体畸变的一线筛查方法，但NIPT可以被认为是对有腹腔穿刺禁忌证或担心与手术相关的胎儿流产的妊娠的可接受的替代方法[16]。

4 NIPT-plus的发展前景

基于cfDNA分析的非侵入性产前检查已改变了产前保健。以适当的费用进行NIPT是在一般妊娠人群中对常见胎儿三体性进行经济高效高灵敏的一线筛查策略。与常规筛查相比，NIPT初级筛查提高了三体检查的整体检出率，并提供了更有效的介入式检查参考，从而减少了进行侵入性产前检查的次数与手术相关的流产和其他与手术相关的并发症。NIPT能够检测T21/T18/T13和几种性染色体疾病，但不能检测结构异常，镶嵌，微缺失或微重复。NIPT无法检测到任何大小小于2Mb的染色体失衡，这可能反映了它对深度序列或读取低浓度母体血液cff-DNA模板的局限性[17]。这些不可检测的异常大多数不是致命性的，但从长远来看，会通过增加不孕和流产的风险来影响生殖健康。最近，NIPT的进一步发展集中在对由节段染色体失衡引起的微缺失/微重复综合征(MMS)的附加分析上。尽管MMS相对少见，但它们共同代表了很大的一组染色体疾病，占所有新生儿先天性异常的1%-2%，通常给家庭和社会造成沉重负担。增强的NIPT方法(NIPT-Plus)对染色体微缺失/微重复，例如DiGeorge综合征，(22q11.22微复制，每3000-6000个新生儿会出现一个此染色体异常新生儿)，镶嵌性和不平衡易位等染色体异常则能够进行检测[18]。据研究，NIPT-Plus显示出适用于检测复发性MMS甚至潜在的全基因组MMS的一级筛选方法的标志。NIPT-Plus在检测具有临床意义的微缺失和微重复方面表现出很高的灵敏度和特异性，而在检测常见的非整倍体方面也保持了很高的灵敏度和特异性[2]。在过去的几年中，也曾有多次报道提示，通过NIPT发现了先前隐匿的母体恶性肿瘤(淋巴瘤，白血病，卵巢，结直肠，肛门，和神经内分泌癌和平滑肌肉瘤)。[19,20]无创产前检测对于母体疾病早期诊断和治疗是否会导致更好的生存率也需要更进一步的数据收集及研究。

5 总结

尽管NIPT已被临床医生和患者广泛接受，以检测常见的胎儿三体性和性染色体异常，但仍存在关于检测罕见染色体疾病综合征的附加临床价值的争论。2016年，美国医学遗传学与基因组学院更新了共识性指南，并建议无创性产前检测(NIPT)可以代替传统的血清学产前筛查[21]。在我国，越来越多的围产期医生也倾向于优先推荐使用NIPT进行产前检测[22]。所有打算评估具有染色体异常胎儿可能性的孕妇都可以选择产前检查，而筛查阶段为阳性或有其他危险因素的妇女则需要进行产前诊断：例如孕产妇高龄(35岁及以上)，遗传病的家族病史或超声检查异常。在我国，通常建议35岁以上的孕妇直接接受侵入性产前诊断。但是，越来越多的专家认为，将年龄作为选择产前诊断的唯一指标是不合适的。鉴于NIPT在产前检查中的地位，因此应实施周到的指导方针，同时还要对从业人员和患者进行更好的教育。如果没有指南，NIPT可能会导致不适当地的医疗实践，损害患者的知情和自由选择权。关于当前的NIPT指南，ACMG提倡将其用于常见的非整倍性染色体异常，且NIPT阳性结果也需要结合侵入性产前诊断[21]。NIPT-Plus在检测三体异常，SCA和与DiGeorge综合征相关的最常见的22q11.2微缺失方面表现出高性能，据此，对于染色体微缺失比染色体非整倍性更为频繁的年轻女性，可以常规进行NIPT-Plus筛查。使用NIPT进行产前检测正变得越来越普遍，而NIPT-Plus还将提供检测染色体疾病综合征的少见及罕见异常的可能性，这些染色体疾病综合征在胎儿超声检查上没有可见的异常，包括与智力障碍，发育迟缓，自闭症以及大多数SCA相关的综合征。因此，如果持续使用NIPT-Plus对所有孕妇进行一线筛查，则可能对降低患有这些综合征的新生儿的发病率及产生的重大影响。最后，临床医生应熟悉所用测试的性能，并了解诸如产妇年龄和BMI之类的产妇状况的影响，来综合决定适宜的产前检测方式。