葡萄糖氧化酶在苹果汁中的抗氧化作用评价

杨玉贤，肖文静，段垒，胡攀，江正兵，李华南

(1.湖北大学生命科学学院， 湖北 武汉 430062; 2.武汉新华扬生物股份有限公司， 湖北 武汉 430074)

0 引言

苹果是我国产量最大的水果之一，资源非常丰富.苹果中含有大量的苹果多酚、三萜、植物甾醇、维生素及其他微量元素[1]，有较高的抗氧化性、抗恶性细胞增殖性和化学防护作用[2].苹果榨汁便是一种便捷营养的健康饮品.但是，在生产加工及储藏过程中易受到褐变的影响，使其观感与营养风味大大降低.因此针对苹果汁的抗氧化褐变是果汁生产商关注的重点.苹果汁中存在的多酚氧化酶是导致褐变的一个重要因素，它可以氧化果汁中的多酚类化合物使其生成具有颜色的醌类.有研究表明苹果中的总多酚、原花青素、儿茶素、氯菌素与褐变有较高的相关性[3].

目前控制褐变过程的主要策略是抑制多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性或将醌类化合物转化为无色物质[4].亚硫酸盐是众所周知的还原剂，曾是有效和最常用的抗褐变剂[5].但是，它对人体有不良影响.因此亚硫酸盐的使用受到限制[6].抗坏血酸也是一个较好的抗褐变剂[7]，其在较高浓度(>1.5%)时立即将形成的醌还原为无色底物，而低浓度则作为PPO竞争性抑制剂[4].其他一些研究发现从肉桂中提取的香豆素[8]、绿茶提取物[9]、植酸[10]、活性羰基[11]等都可以抑制苹果汁的褐变.其次，从PPO的源头释放方面来看，由于PPO在完整活细胞中存在于质体和叶绿体中，多酚存在于液泡中，从而不会发生褐变[12].强剪切力会使细胞受到严重损伤导致PPO大量释放，因此使用温和低速研磨的方式也可以减轻果汁褐变[13].

PPO对果汁中的多酚化合物的氧化需要氧气的参与.因此，减少果汁中的氧气可以有效降低PPO的活性.本研究采用葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)作为抑制褐变的添加剂，探究降低氧含量对褐变带来的影响.GOD是一种需氧脱氢酶，在有氧条件下能高度专一地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢[14].GOD目前应用在食品行业一方面可以转化葡萄糖，改善鲜虾等加工贮存中美拉德反应带来的褐变[15].另一方面可以消耗氧气，抑制好氧微生物的生长繁殖从而达到保鲜目的[16].且GOD已经被证实对人体安全无毒.目前，已用作各种食品添加剂来达到保鲜效果[17-18].本研究从加入GOD的方式及剂量对苹果汁褐变、果汁中含氧量、多酚氧化酶活性及多酚类物质含量变化的影响等因素综合评价GOD在苹果汁制备及储存中的抗氧化作用.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂苹果品种为红富士，购自武汉本地超市保存于4 ℃直至使用；GOD(GenBank no.X16061.1)由已构建的重组毕赤酵母GS115发酵所得；磷酸盐等无机试剂，甘油，葡萄糖均购自国药集团有限公司；聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpolypyrrolidone，PPVP)、辣根过氧化物酶购自Biosharp，邻苯二酚购自Macklin.

1.2 仪器与设备JYL-C051榨汁机 中国九阳公司；M-100生物传感分析仪 中国西尔曼公司；HQ30 d便携式溶氧仪 美国HACH公司.

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖氧化酶(GOD)的制备及酶活测定方法 将YPD活化的种子液接入装有20 L BSM培养基的发酵罐中进行分批培养，28%氨水调节pH为6.0，通气量保持2.0 vvm，转速自动控制溶氧≥10%.当葡萄糖耗尽后溶氧迅速升高，此时开始每小时取样检测葡萄糖的浓度，并以6.4 mL/(L·h)流加补料生长培养基10～20 h，至菌体干重80～90 g/L.停止葡萄糖流加后让菌体饥饿2 h后，缓慢补入甲醇诱导培养基，密切注意溶氧不低于10%，4 h后菌体完全适应了甲醇的代谢，进行诱导表达培养，采用最大转速800 r/min，诱导培养约130 h.诱导发酵完成后进行初步纯化.

GOD酶活测定参考Sigma的方法.称取0.1 g邻联茴香胺溶于10 mL甲醇中作为储存液，使用前取0.1 mL于12 mL磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH 6.0)中.在试管中加入2.5 mL邻联茴香胺溶液,0.3 mL 18%的D-葡萄糖溶液和0.1 mL辣根过氧化物酶溶液(90 U/mL)，30 ℃保温5 min，加入待测葡萄糖氧化酶，反应3 min后加入2 mol/L H2SO4终止反应，在540 nm下测定反应液吸光值.以稀释的葡萄糖氧化酶标准品做标准曲线.GOD酶活单位(U)定义为该条件下，每分钟催化1 μmolD-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢的酶量.

1.3.2 苹果汁的制备与处理 将苹果从冰箱取出后洗净去皮，切成约2 cm × 2 cm小块，每50 g苹果加入200 mL纯水至榨汁机中榨制30 s，8层纱布过滤.向每20 mL果汁中分别加入体积比为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的GOD.经初步纯化稀释后测定GOD酶活为1 013 U/mL，至终体系中GOD分别为0、2、4、6、8、10 U/mL.对照组分别将以上不同量的GOD加入到苹果与水的混合物中同步榨汁，后续操作相同.

1.3.3 果汁褐变度的测定 用Bonggi Lee等人提出的分光光度法测定鲜苹果汁的褐变指数[19]，以A420表示.将制备好的苹果汁以10 000 g离心2 min，取上清，用分光光度计在10 mm比色皿中测定在420 nm处的吸光度值.用吸光度值表示果汁的褐变程度，吸光度值越大表示果汁褐变程度越大.

1.3.4 溶解氧含量与葡萄糖含量的测定 取加入GOD同步榨取的苹果汁立即测定其中的溶解氧含量.溶氧仪校准后置于新鲜榨取的果汁中，待读数稳定后直接读出氧气质量浓度.

取以上制备的果汁各10 mL，置于100 ℃水浴锅中15 min使GOD失去活性，稀释后用葡萄糖分析仪生物传感器测定溶液中的葡萄糖含量.葡萄糖标准溶液定标，上样测定果汁溶液，读出葡萄糖质量浓度.

1.3.5 多酚氧化酶(PPO)的提取与测定 PPO的提取与测定根据已有方法[20]稍作改动.以PVPP作为酚类清除剂，向10 mL苹果汁中加入4 % PVPP(w/v)剧烈摇晃，12 000 r/min离心5 min，上清液即作为粗酶液.PPO活性的测定以邻苯二酚为底物，向反应体系中加入新鲜配制的50 mmol/L邻苯二酚1.0 mL，1.0 mL磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH 6.5)，酶提取物1.0 mL.邻苯二酚溶液和磷酸盐缓冲液在使用前在30 ℃温浴，记录反应一分钟在400 nm处的吸光度值变化.PPO酶活性单位(U)定义为在该条件下每分钟使吸光度值增加0.001所需的酶量.

1.3.6 多酚类化合物的测定 委托青岛科创质量检测有限公司对果汁样品进行代谢物全谱分析，通过色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)技术鉴定样品中小分子化合物，测定部分多酚类化合物的相对质量浓度.使用LC-MS仪器分析平台，C18色谱柱进行分离.使用Compound Discoverer 3.0进行保留时间矫正、峰识别、峰提取等工作，根据二级质谱信息利用Thermo mzCloud在线数据库、Thermo mzValut本地数据库，进行物质鉴定。

1.4 数据分析每组处理重复3次.结果表示为平均值 ± 标准差.使用SPSSAU-在线SPSS分析软件对所有数据进行统计分析.当p<0.05时被认为有显著差异.使用Excel对实验数据作图.

2 结果与分析

图1 GOD对果汁褐变的影响

2.1 GOD的添加量及添加时间对果汁褐变度的影响苹果汁中加入GOD可有效降低其氧化褐变程度，本实验比较了GOD的添加量及加入时间对褐变影响的差异.研究发现加入GOD同步榨汁可更有效地减轻褐变程度(图1).榨制前加入0.2% GOD可使苹果汁在420 nm处的吸光度值降低42%，榨取后加入GOD仅降低了18%.这是因为在果汁榨制的过程中，榨汁机刀片的高速转动使果汁与空气的接触面积大大增加，这极大提高了果汁中的氧气含量使PPO快速作用从而发生褐变，榨制前加入的GOD可快速消耗果汁中的氧气从而减缓PPO的作用.随着GOD的添加量增多，其抑制作用效果并没有显著提高(p>0.05).GOD对果汁褐变作用的视觉效果见图2，在观感上添加0.2%的GOD与更高添加量无显著差异，因此，从经济学角度考虑实际应用中可以选择加入果汁体系体积0.2%的GOD.

A：不加GOD； B：0.2% GOD； C：0.4% GOD； D：0.6% GOD； E：0.8% GOD； F：1.0% GOD

将未添加GOD与添加了0.2% GOD的果汁装瓶置于4 ℃储存，每5天测定一次吸光度值.结果表明，第20天时未加酶处理的果汁褐变度增加了约79.2%，而用GOD处理后褐变度仅增加了18.6%(图 3).这表明GOD对果汁的抗氧化有长期稳定的作用.

图3 GOD在果汁储存中的抗褐变作用

图4 GOD对果汁溶氧及葡萄糖含量的影响

2.2 GOD的添加对果汁中溶解氧含量的影响通过测定果汁中的氧气含量，发现未加入GOD的果汁榨取结束时溶解氧含量为4.0 mg/L；加入GOD的果汁榨制结束时溶解氧含量减小了至少20倍，均低于0.2 mg/L(图 4).说明在榨汁过程中GOD消耗了果汁中的大量氧气，这就解释了为什么加入GOD同步榨汁可以更有效地降低果汁的褐变程度.随着GOD的增加，果汁中的氧气含量下降并不显著(p>0.05).因此，抑制褐变的效果没有明显增强.

2.3 GOD的添加对葡萄糖及葡萄糖酸含量的改变通过测定果汁中的葡萄糖含量，发现加入GOD 1 h后果汁中的葡萄糖含量有明显降低，加入0.2%的GOD使葡萄糖含量降低了约10%(图 4).HPLC-MS/MS测定得到经过GOD处理的果汁中葡萄糖酸的相对含量达11.79 mg/L，未处理的仅0.09 mg/L.而且葡萄糖酸被认为是一种安全的食品添加剂，通常被添加到乳制品和软饮料中以保持其感官特性[21].

2.4 GOD的添加对PPO活性的影响众所周知，PPO会引起果汁的褐变.进一步分析了加入GOD对PPO活性的抑制作用.结果表明，GOD对果汁中的PPO活性有显著影响(p<0.05)，加入0.2%的GOD就可抑制67.5%的PPO活性，这就使得果汁的褐变程度大大降低(图5).随着GOD添加量的增加抑制作用增强，主要是因为GOD消耗了果汁中的大量氧气，从而竞争性地抑制了PPO的需氧氧化.

图5 GOD对果汁中多酚氧化酶活性的影响

图6 GOD对果汁中部分多酚类化合物的影响

2.5 GOD的添加对多酚化合物含量的影响氧气浓度低于5%，可以通过PPO控制苹果中酚类底物的氧化[22].本研究测定了苹果汁中部分多酚类化合物的相对质量浓度(图6)，测定结果表明未经过GOD处理的果汁中不含儿茶素和绿原酸.绿原酸是大多数品种苹果果实中的主要成分，并且是PPO的最佳内源性底物[23].表明未经处理的苹果汁中更高的PPO活性产生作用，将绿原酸等多酚类化合物氧化.

此外，GOD的加入使苹果汁中的5-羟甲基糠醛减少了0.2 μg/mL，不加GOD的果汁中为5.48 μg/mL.5-羟甲基糠醛是美拉德反应、焦糖化反应及抗坏血酸氧化分解反应的共同中间产物[24]，且与果汁的褐变呈指数关系[25].因此，5-羟甲基糠醛的减少对果汁褐变的抑制是有利的.

3 讨论

在果汁抗氧化中的添加剂力求天然无害，不破坏果汁本身的营养风味，并且果汁生产经济便捷.GOD作为一种抗褐变添加剂基本符合以上几点要求.目前，有报道在真空下研磨苹果汁以达到分离氧气的作用，该作用可有效抑制果汁的褐变[26].但是，在实际应用中并不便捷，对于小型应用场所例如餐厅、咖啡厅来说较难达到使用条件，因此，榨制前加入GOD可快速消耗果汁中的氧气从而减缓PPO的作用，达到抑制苹果汁褐变的目的，具有方便经济快捷等优点.研究发现通过GOD处理的苹果汁，糖含量可降低21%，餐后血糖和静脉血清胰岛素响应分别降低68%和47%，导致血糖负荷降低74.6%，而且没有任何不良的胃肠道副作用[27]. 本研究表明GOD的添加使果汁中的糖含量降低，这对空腹血糖受损病人是有利的，也符合当代人低热量健康饮食的理念.GOD消耗果汁中的大量氧气，而较低的氧浓度可用于在贮藏期间保持新鲜水果中更高水平的酚酸和维生素C[28]，且有一些研究已表明多酚化合物具有抗氧化、抗癌[29]、降血压[30]等特性，此酶处理对果汁营养的保留具有积极作用.GOD作为一种具有活性的酶蛋白，在实际储存运输中可能存在一定的限制，未来的研究中可以尝试与其他添加剂联合使用以增强其商业稳定性.

4 结论

本研究通过对苹果汁褐变度、果汁中含氧量、多酚氧化酶活性及多酚类物质含量等因素的测定综合评价了GOD在苹果汁制备及储存中的抗氧化作用.选择榨汁过程中同步加入GOD可以比榨汁后加入更有效地抑制果汁褐变，添加果汁体系体积0.2%的GOD就能达到较好的抗氧化效果.GOD的加入使果汁含氧量降低95%，同时减少果汁葡萄糖含量.通过抑制67%的PPO活性保留了儿茶素和绿原酸等多酚类化合物，使果汁的营养更丰富.