慢性乙型肝炎相关原发性肝癌的生物标志物：新的发现和未来之路

陈忠伟，樊怡昕，胡汉宁，魏艳红，胡康洪，叶啟发

(1.湖北工业大学中德生物医学中心， 工业微生物湖北省重点实验室， 湖北 武汉 430068;2.武汉大学中南医院检验科， 湖北 武汉 430071； 3.武汉大学中南医院， 武汉大学肝胆疾病研究院， 湖北 武汉430071)

0 引言

据国际癌症研究机构统计[1]，原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界第六大最常见的癌症，在男性中占第五位，在女性中占第九位，也是致死率位居第二位的恶性癌症.在世界范围内，约80%的肝癌是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染引起的[2].跟踪中国人群评估发现，慢性乙肝病毒感染患者发生肝癌的风险比未感染人群高出约20倍[3].

在大多数情况下，HCC是在中晚期被诊断出来的，并且HCC患者的预后较差，其5年生存率不到5%[4].因此急切需要寻找肝癌的特异性生物标志物，用于诊断早期肝癌和预后分类，从而降低肝癌死亡率和医疗费用.目前推荐肝硬化患者的筛查策略包括测定血清甲胎蛋白(alapha-fetoprotein, AFP)水平和每6个月进行一次腹部超声检查[5].对于肝脏超声和血清AFP筛查异常者首选的影像学检查方法是动态增强CT和多模态MRI扫描.系统回顾显示，B超的灵敏性为58%，特异性为94%，CT的灵敏性为68%，特异性为93%，而MRI的灵敏性为81%，特异性为85%[6].另外影像学检查的可靠性受限于医师的经验，以及不同人种不同年龄患者检测结果存在差异[7].因此，寻找新的特异性标志物，从而更好地诊断或预测HCC仍然是一个重要的临床关切.本文中就HBV相关HCC诊断和预后密切相关的外周血生物标志物研究进展作一综述，并对其前景进行展望.

1 常见乙型肝炎病毒相关肝癌蛋白质标志物

1.1 糖基化的α-甲胎蛋白(AFP)长期以来，α-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)与腹部超声广泛应用在常规的HCC筛查中.AFP是一种由胎儿卵黄囊和肝脏产生的蛋白质，可结合外源和血液中的内源性物质[8].成年人血清AFP水平极低，一旦异常升高，则与急性肝炎、窦性肿瘤、肝细胞癌等多种癌症有关[9].然而Yao等[10]的研究显示，只有70% 的HCC患者在诊断时AFP水平明显升高，即使在最佳检测条件下，运用AFP检测HCC的灵敏度最高也只能达到75%.鉴于此，寻求准确性更高的生物标志物具有重要临床意义.

不同疾病产生的糖基化的AFP，依据糖链结构上的差异，分为AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3 3种，它们在诊断早期HCC和鉴别肝病恶性情况方面，特异性高于AFP，其中AFP-L3占血清总AFP的比例与肿瘤的恶性程度有关[11].Waidely等[12]研究提出，在AFP水平正常情况下，AFP-L3的升高也可作为HCC的诊断指标.但Witjes等[13]发现不同的研究使用不同的标准，限制了AFP-L3的临床运用潜能，其可靠性还需要进一步验证.

1.2 骨桥蛋白(OPN)骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种与整合素结合的糖磷蛋白，是构成骨和牙齿细胞外基质的重要组成部分.OPN参与了发育过程、免疫过程、致瘤过程和骨平衡过程[14].OPN在结肠癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤和其他肿瘤中均有表达，在HCC中OPN的水平高于正常组织[15].Wan等[16]发现，OPN的灵敏度优于AFP(86%>66%)，但其特异性略低于AFP(86%<95%)，认为它是一个可与AFP相媲美的潜在诊断标志物.但由于HCC异质性限制，需进一步大样本评估OPN临床应用的准确性及OPN与AFP的联合应用价值.

1.3 脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)脱-γ-羧基凝血酶原(des-gamma carboxy prothrombin, DCP)，也称血清异常凝血酶原Ⅱ(protein induced by vitamin K absence, PIVKA-Ⅱ)，是一种非羧基化的凝血酶原，已被证实是一种致癌因子并介导HCC增殖与侵袭[17]. Xing等[18]观察到，和AFP相比较，无论是针对< 3 cm的小肝癌组织的诊断，还是≥3 cm的大肝癌组织的诊断，DCP的AUC值即ROC曲线下面积(area under the ROC curve, 简称AUC)均更优，提示DCP 是一种能够替代AFP的诊断指标；日本、韩国及印度批准其作为HCC的有效标志物，尤其是判断肝内转移和预后.但鲁凤民[19]等研究发现维生素K缺乏或者饮酒也会导致DCP含量升高，这在一定程度上会干扰诊断结果.Song等[20]将DCP与AFP结合诊断早期HCC，灵敏度高达94%，特异性高达98.5%.因此联合不同的生物标志物进行检测，能极大提高诊断效果.

1.4 磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)磷脂酰肌醇聚糖-3(glypican-3,GPC3)是一种锚定在质膜上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖.Gao等[21]研究报道GPC3通过刺激Wnt信号通路促进肝癌生长.GPC3在黑色素瘤、神经母细胞瘤和肝母细胞瘤中低表达，在乳腺癌、肺腺癌、胆管癌和正常肝组织中无表达，但在70%的HCC患者中高表达.Dong等[22]发现GPC3可能是肝癌靶向性成像诊断中的理想肿瘤标志物.Xu等[23]通过系统性回顾和荟萃分析发现，血清GPC3的灵敏度与AFP 相近(55%>54%)，但其特异性低于AFP(58%<83%).联合AFP诊断HCC的灵敏度(85%)明显高于单独使用血清GP73或AFP.虽然GPC3被认为是一种新的HCC血清标志物，但由于HCC的异质性，导致其诊断结果并不一致[24].

1.5α-L-岩藻糖苷酶(AFU)α-L-岩藻糖苷酶(alpha-L-fucosidase, AFU)是一种存在于所有哺乳动物细胞中的溶酶体酶.Yang等[25]报道血清AFU在乙型肝炎相关肝癌的患者中水平升高，且在多种肝癌筛查方法中，血清AFU是肝癌特异性标志物最突出的.Mossad等[26]研究发现，血清AFU和鳞状细胞癌抗原-免疫球蛋白M复合物(squamous cell carcinoma antigen-immunoglobulin M complex, SCCA-IgM)联合诊断时，HCC和肝硬化患者SCCA-IgM和AFU水平差异显著，可识别没有AFP升高情况下的HCC.因此，AFU可能发展为诊断生物标志物.

1.6 其他常用于辅助诊断HCC的抗原有癌胚抗原(CEA)、癌抗原199(CA199)、癌抗原125(CA125)、癌抗原50(CA50)及癌抗原153(CA153)等, 各医院以多个抗原抗体的组合检测提高HCC的诊断率，常见组合有AFP/CEA/CA199或AFP/CA199/CA125/CEA.此外，对于HBV相关HCC患者需要长期监测HBV基因型和变异类型、血清HBe Ag、血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和HBV DNA水平等.

2 新发现的标志物

2.1 非编码RNA

2.1.1 微小RNA(miRNA) 微小RNA(microRNAs,miRNA)是一类小的、内源性的非编码RNA分子，通过负性调节靶mRNA的稳定性或翻译效率来调节基因的转录后表达，参与调控细胞增殖、分化和凋亡多种生物学过程[27].目前miRNA被认为是最具潜力的诊断标志物，其中miR-21，miR-122在HBV相关肝病不同阶段均有异常表达，并与AFP水平相关.

miR-21参与肝脏的发育、分化、稳态和代谢功能，以程序性细胞死亡蛋白4(programmed cell death 4, PDCD4)和磷酸酶张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue, PTEN)为靶点，调节细胞的凋亡抗性[28].Huang等[29]研究发现，外周血较高水平的miR-21与肝癌分化程度、进展程度正相关，预示不良后果.

Hsu等[30]报道miR-122是一种肝脏特有的miRNA，通过抑制ATK和MAPK等相关细胞信号通路抑制肿瘤，miR-122的缺失导致分化受阻、基因组不稳定以及炎症，Lou等[31]研究发现通过间充质干细胞介导的miR-122转运能提高HCC化疗敏感性，有望成为肝癌化疗的潜力策略.

目前利用miR-122, miR-21, miR-192, miR-223, miR-26a, miR-27a和miR-801等7种血浆miRNA的表达水平建立的肝癌诊断模型其灵敏度较AFP提高约30%，而且在AFP阴性的病患中，仍能做出准确的诊断(敏感度可达77.7%，特异度可达84.5%)[32].基于该循环miRNA模型的肝癌检测试剂盒已经多中心临床实验验证(n=1 812)，并获国家药品监督管理局三类医疗器械注册证，已进入临床应用.

2.1.2 环状RNA(circRNA) 环状RNA(circular RNA, circRNA) 是一种共价闭合环状结构的内源性非编码 RNA 分子，不具有5’端帽子和3’端 poly(A) 尾巴，呈环状，具有稳定的结构和组织特异性[33].近来研究发现，circRNA在HCC中有不同程度的表达，在HCC的发生和发展中起着重要的作用，可能成为HCC的诊断标志物，但其在HCC发生发展过程中起哪些关键作用尚不清楚.

Yu等[34]研究发现Cdr1as(又称CIRS-7)通过靶向miRNA-7在肝癌中发挥癌基因作用，在肝癌组织中Cdr1as表达上调，使miRNA-7表达下调.Cdr1as表达增加与肝微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)、甲胎蛋白(AFP)水平、年龄和HCC恶化密切相关.Xu等[35]研究报道Cdr1as在伴有MVI的肝癌组织中的表达与miRNA-7呈负相关，与两个miRNA-7靶基因(PIK3CD和p70S6K)呈正相关.

Yu等[36]研究发现cSMARCA5(也称Hsa_CIRC_0001445)是区分HCC患者与健康对照以及肝硬化或慢性乙肝患者的相当准确的标志物.Zhang等[37]报道cSMARCA5通过海绵miRNA-17-3p和miRNA-181b-5p促进肿瘤抑制因子TIMP3，从而抑制肝癌细胞增殖和迁移.此外，cSMARCA5的低表达也可能是肝切除术后HCC患者总体生存(OS)和无复发生存(RFS)的独立危险因素.

2.1.3 长链非编码RNA 长链非编码RNA(long non-coding RNAs, LncRNA)属于一类长达200 bp的非编码RNA分子，广泛存在于血浆、血清、尿液中，可作为诊断HCC或预后的潜在标志物[38].尽管LncRNA不能编码蛋白质，但越来越多的证据表明，它们在HCC的发展过程中，通过靶向大量的关键蛋白编码基因、miRNAs和信号通路，在细胞增殖、侵袭和转移、自噬和凋亡中起重要作用[39].

当前研究中，由HBV或HBx引起LncRNAs失调较为关注的是HBx-LINE1 (fusion of the human cellular long interspersed nuclear elements and HBx)和Unigene56159，均只在HBV相关的HCC患者中表达，具有较好的特异性，是潜在的生物标志物.

Lau等[40]证实HBx-LINE1是HBV DNA和宿主序列LINE1的一种特殊的嵌合转录产物，它证明了HBV DNA可能通过整合到宿主细胞的基因组中激活Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌发展，并且在23.3%的HBV相关HCC患者中可检测到该基因.Liang等[41]研究表明HBx-LINE1可以作为miR-122的分子海绵，通过耗尽miR-122，促进肝细胞β-catenin信号的激活、E-钙黏附素的还原和细胞迁移，并导致小鼠肝细胞有丝分裂异常和肝损伤.Lv等[42]研究发现Unigene56159在HBV相关的HCC组织中高表达，可作为miRNA-140-5p的竞争内源性RNA，抑制靶基因Slug的表达，从而促进HCC的细胞迁移，侵袭和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT).

2.2 病理学标志物

2.2.1 角蛋白19(keratin 19, K19) K19是病理学常用的预后标志物之一，其表达与射频消融后的高复发率有关[43]. Govaere等[44]在韩国的HBV 相关HCC的队列中确定K19的预后价值，它与肿瘤大小、肿瘤分化程度降低、转移和微血管侵犯显著相关.Kawai等[45]证实肝癌中K19与转化生长因子-β(Transforming growth factor-beta, TGF-β)途径以及上皮-间充质转化(EMT)之间的关联，表明K19有望成为抑制TGFBR1的治疗靶点.

2.2.2 上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM) EpCAM是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白.Julich-Haertel等[46]利用荧光激活细胞扫描技术发现EpCAM+与肿瘤恶性程度、预后不良相关，且具有作为HCC液体活检标志物的潜力，可无创区分肝癌患者与慢性肝硬化患者.Takai等[47]研究确定PMPCB对线粒体稳态的重要性，通过失活Wnt/β-catenin信号通路选择性杀死高度耐药的EpCAM+肝癌肿瘤.Dai等[48]采用免疫组织化学方法检测106例接受肝切除术的HBV相关HCC患者发现EpCAM+与肿瘤大小、肝硬化和血管浸润显著相关.

2.2.3 CD90 CD90是一种由不同类型的细胞表达的GPI锚定蛋白，具有调节细胞凋亡、细胞黏附、迁移、纤维化的作用[49].Xia等[50]研究发现CD90激活mTOR通路对阿霉素的化疗耐药.Luo等[51]研究表明CD90+细胞具有更强的致瘤性、化疗耐药性、肿瘤侵袭和转移能力，因此，CD90作为肝癌的靶向治疗值得进一步研究.Zhao等[52]临床分析显示CD90与病理分级、卫星病变、门静脉癌栓和复发临床病理参数呈正相关，提示CD90是肝切除后HCC患者预后的可靠生物标志物.

2.2.4 CD133 CD133是一种与胚胎上皮细胞质膜突起特异相关的跨膜糖蛋白.Jang等[53]研究发现CD133可用于维持EGFR介导的致癌信号.此外，EGFR缺陷的CD133+肝癌细胞对抗癌药物的敏感性高于对照CD133+肝癌细胞，表明CD133可作为新靶点对耐EGFR靶向药物的肝癌细胞增敏.Kim等[54]发现在HCC中CD133的过表达预测了对索拉非尼的不良反应.Song等[55]研究提示CD133在肝癌细胞活性氧防御和逃避抗癌治疗中起重要作用，此外，柳氮磺胺吡啶联合常规化疗可能是治疗CD133+肝癌细胞的有效策略.

2.2.5 CD13 CD13是一种膜糖蛋白，也是一种胞外肽酶，其主要功能是将单个中性氨基酸从小肽的N端裂解出来.Sun等[56]报道CD13+/CD133+和CD13+/CD90+细胞不仅可以增强肝癌的起始性，而且可以增强对阿霉素(DXR)和氟尿嘧啶(5-FU)的化疗耐药性. 有趣的是，Yang等[57]在人肝癌细胞中发现，CD13不仅可以被遗传毒性化疗药物诱导，也可以被索拉非尼诱导.Yamanaka等[58]研究临床资料发现CD13的表达与E-cadherin、vientin等EMT标志物的表达密切相关，提示CD13可作为术后早期复发的预后标记物.

2.2.6 SAL样蛋白4(Sal-like protein 4, SALL4) SALL4是一种锌指转录因子，参与细胞增殖和维持多能性，Oikawa等[59]发现SALL4在肝癌中与细胞和肿瘤生长相关，且与5-FU耐药有关，可抑制分化延缓肿瘤生长，表明SALL4是治疗肝癌的潜在靶点.Tsujikawa等[60]通过免疫组织化学研究发现SALL4+的肝癌分化差，门静脉浸润和/或肝内转移发生率高，增殖活性高.

2.3 其他除了上述介绍外，研究者发现细胞因子类标志物具有治疗HCC的潜力，例如转化生长因子-β(TGF-β)可作为肝癌治疗靶标[61]；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是肝癌治疗药物索拉非尼的靶点之一[62]；成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)有助于克服肝癌对索拉非尼的耐药性[63]；肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)/间质表皮转化因子 (c-mesenchymal-epithelial transition factor, c-Met)信号通路(HGF/c-MET)的异常激活参与肝癌的发生[64]，提示抑制c-Met可能具有治疗潜力.当前国内治疗c-MET阳性肝细胞癌处于Ia/Ib期临床试验(CTR20190632).但关于此类标志物的临床应用方案仍需要深入探究.

另外，还有研究者发现循环基因和细胞类标志物也有潜力应用于HCC的诊断与预后，比如循环肿瘤细胞 (circulatng tumor cell, CTC)[65]、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)[66]、AFP-mRNA[67]、游离DNA(circulating cell-free DNA, cfDNA)[68]等，但它们的临床有效性依然需要验证.

3 未来趋势与讨论

3.1 多标志物多指标联合检测由于HCC的异质性，并不存在一个具有100%灵敏度和特异性的单一生物标志物，因此，考虑如何科学优化已知的潜在标志物组合是一种提高诊断准确率的方法.根据中华人民共和国国家卫生健康委员会出台的《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》中指出，对血清AFP阴性人群，可借助AFP-L3、PIVKA II和血浆游离微小核糖核酸(microRNA)进行早期诊断.临床诊断HCC利用外周血蛋白质标志物联合非编码RNA作为常规临床指标已成为趋势.

此外，在乙型肝炎相关肝癌的临床诊断中大多数医院将患者凝血功能指标纳入治疗参考，包括活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplatin time, APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen, FIB)、凝血酶原时间(prothrombin time, PT)、凝血酶时间(thrombin time, TT)、凝血时间(clotting time，CT)和国际标准化比值(international normalized ratio，INR)等，各医院选取其中几项检测，称为凝血X项，再结合肿瘤标志物水平可实时监测患者凝血功能与肿瘤的情况，并予以有效的治疗措施进而减少肝脏相应并发症，最大程度上降低病死率.

2018年由国家肝癌科学中心/上海东方肝胆外科医院和广州南方医院等多家单位进行多中心、前瞻性万人队列肝癌及早期预警标志物筛查项目PerCar，该模型基于生化血清标志物(AFP、AFP-L3、DCP)、影像学(US、CT、MRI)和血浆cfDNA高通量检测，其灵敏度高达95.7%，特异性高达93.1%，目前该研究产品于2020年正式上市，可用于高危人群的早筛早诊以及肝癌患者的复发监控.

3.2 未来检测新技术蛋白芯片技术具有高通量，高敏感度，提高诊断阳性率等特点，在临床检测多种肿瘤标志物中具有较高应用价值.功能性成像技术是基于动态计算机断层扫描、动态磁共振成像和扩散加权磁共振成像的方法，在肝癌早期诊断以及检测纤维化程度或血管生成等方面的变化发挥越来越大的作用.数字化病理分析技术实现多人会诊，客观快速，减少个体诊断差异，在病理学方面极有应用前景.最后，单细胞监测分析技术和人工智能(artificial intelligence, AI)在癌症诊断方面初露锋芒.在未来，联合现代科学新技术与上述潜在生物标志物，无疑是提高临床诊断准确性的重要手段.

3.3 标志物的科学研究方法在生物标志物研究中大规模的临床验证尤为重要，Liu等[69]在4 016例的临床应用中发现，HCC患者血清高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)升高与患者肝硬化背景有关，证实血清GP73不能作为HCC的诊断指标，而有可能成为诊断肝硬化的潜在指标.除此之外，还应考虑不同地区种族的生物代谢特征，Costa等[70]研究证实，骨桥蛋白(OPN)和潜在转化生长因子β结合蛋白(latent-TGF β binding-protein 2, LTBP2)诊断HBV相关HCC时，在相同的cut-off值下，两种标志物的灵敏性和特异性在各种族之间均有差异.

在生物标志物研究中，cut-off值在区分阴性患者和阳性患者中具有重要作用，合理的cut-off值能降低漏诊率且避免不必要的经济负担和心理创伤，但大多数研究中，阴性血清样本量和正常的血清样本量均少于1 000，极少考虑解决假阳性和假阴性的影响.鉴于此，如何科学设置cut-off值仍需要继续研究.

到目前为止，大多数血清标志物研究都是单中心、回顾性的研究，其中最大的问题是缺乏可靠的科学设计和可重复验证的研究方法.Brazma等[71]提出需要制定标准化研究方案，以便能够重复实验结果，使结果更具有严谨性和准确性.

3.4 讨论理想的肿瘤标志物除了具有高灵敏性和高特异性, 还应具有操作方便、灵敏可靠、价格低廉、微创甚至无创等优点，但生物体液中RNA的数量和质量都很低，加大了检测难度.在个体之间，甚至在健康人群中外周血RNA存在变异，使得可作为潜在生物标志物的外周血RNA转换为临床诊断指标更加复杂.因此，外周血RNA能否作为可行的生物标志物仍有很多技术瓶颈亟待解决.

肝癌发展过程极为复杂结果极为严重，需要更全面更系统的研究，未来在临床上寻找患者亚类的生物标志物可能有更好的诊断与治疗效果.虽然联合诊断提高了灵敏度和特异性，但也增加了患者的经济负担，现实往往需要兼顾治疗效果和患者经济能力.总而言之，对肝癌肿瘤标志物研究并开发新型有效的标志物仍然道阻且长.