基于UPLC指纹图谱和多成分定量的辛夷药材产地差异性研究

李振雨，何嘉莹，童培珍，魏 梅，孙冬梅，邓淙友，陈向东

基于UPLC指纹图谱和多成分定量的辛夷药材产地差异性研究

李振雨，何嘉莹，童培珍，魏 梅，孙冬梅，邓淙友，陈向东*

广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

采用超高效液相色谱（UPLC）法建立辛夷花药材指纹图谱，并同时测定3种有效成分的含量，评价不同产地辛夷药材质量的差异。采用UPLC法进行测定，色谱柱为YMC Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，体积流量为0.3 mL/min，波长为230 nm，柱温为30 ℃，进样量为1 μL；建立15批辛夷药材指纹图谱，通过对照品比对，对共有峰进行指认，并对3种有效成分的含量进行测定；对15批辛夷药材指纹图谱进行相似度评价、聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA），并利用正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）寻找不同产地辛夷药材的差异性成分。辛夷药材指纹图谱有10个共有峰，指认出其中3个峰，分别为松脂素二甲醚、木兰脂素和木兰花碱；湖北、四川与河南产区药材的相似度为0.585～0.793；HCA和PCA分析将15批辛夷药材划分为3类，分别对应3个不同的产区，OPLS-DA法确定7个差异标志物，差异显著性排序为木兰脂素＞峰4＞松脂素二甲醚＞峰3＞峰8＞峰9＞峰10。河南产区辛夷木兰脂素和松脂素二甲醚含量最高，湖北产区辛夷木兰花碱含量最高。该方法能有效地分析不同产地辛夷药材质量的差异性，为不同产地辛夷药材质量的评价提供参考。

辛夷；UPLC指纹图谱；多成分定量；差异标志物；木兰脂素；松脂素二甲醚

辛夷为木兰科植物望春花Pamp.、玉兰Desr.或武当玉兰Pamp.的干燥花蕾，具有散风寒、通鼻窍的作用，用于治疗风寒头痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊[1]。历代本草都有关于辛夷的记载，《神农本草经》将其列为上品。现代化学和药理学研究表明，辛夷主要含挥发油、木脂素、黄酮、生物碱等多种有效成分，具有抗炎、抗过敏、降压、兴奋子宫等药理作用，临床上多用于治疗鼻炎及鼻窦炎[2-5]。目前，辛夷药材的质量评价多集中在对挥发油和木脂素类成分的测定上[6-8]，对一些水溶性较大的有效成分研究较少。中药成分复杂，针对不同的疾病，发挥作用的有效成分不同，本实验以超高效液相色谱法（UPLC）指纹图谱结合多成分定量，增加对水溶性生物碱的测定，分析不同产地辛夷药材的质量差异，为不同产地辛夷药材的质量评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters H-Class型超高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；YMC Triart C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，日本YMC公司），万分之一天平（ME204E，梅特勒-托利多公司）；百万分之一天平（XP26，梅特勒-托利多公司）；JJ600型百分之一天平（常熟市双杰测试仪器厂）；KQ500D型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HWS28型恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；超纯水系统（Milli-Q级，德国默克股份有限公司）。

1.2 试剂与试药

除液相用甲醇、乙腈（默克股份有限公司），磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）为色谱级，其余试剂皆为分析纯。对照品木兰脂素（批号110882-201708，质量分数为96.5%，中国食品药品检定研究院）；木兰花碱（批号wkq17063003，质量分数为98.0%，四川维克奇生物科技有限公司）；松脂素二甲醚（批号1506434，质量分数为100.0%，伊普赛诺公司）；辛夷对照药材（批号121079-200704，中国食品药品检定研究院）；15批辛夷药材经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定均为木兰科植物望春花Pamp. 的干燥花蕾，经检验，均符合《中国药典》2015年版的规定，药材信息见表1。

表1 15批辛夷药材来源信息

2 方法与结果

2.1 辛夷药材UPLC指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：YMC Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脱（0～15 min，10%～15% A；15～25 min，15%～38% A；25～35 min，38%～44% A；35～39 min，44%～100% A；39～40 min，100% A），体积流量0.30 mL/min；检测波长为230 nm；柱温为30 ℃；进样量为1 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 取松脂素二甲醚、木兰脂素和木兰花碱对照品适量，加50%乙醇制成含松脂素二甲醚50 μg/mL、木兰脂素80 μg/mL、木兰花碱100 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 对照药材参照物溶液的制备 取辛夷对照药材约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 供试品溶液的制备 取辛夷药材粉末（过二号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，称定质量，超声处理（功率300 W、频率40 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.5 精密度试验 取辛夷药材（批号G1703182）供试品溶液，按“2.1.1”项下确定的色谱条件连续进样6次，检测指纹图谱，以木兰脂素色谱峰为参照峰（S），计算各共有指纹峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一批次的辛夷药材粉末（批号G1703182）共计6份，按“2.1.4”项下确定的供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，分别进样测定，检测指纹图谱，以木兰脂素色谱峰为参照峰，计算各共有指纹峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取辛夷药材（批号G1703182）供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样分析，检测指纹图谱，以木兰脂素色谱峰为参照峰，计算各共有指纹峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3.0%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 指纹图谱的建立及共有峰标定 取15批辛夷药材样品，按“2.1.4”项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，另取辛夷对照药材，按“2.1.3”项下方法制备对照药材参照物溶液，分别按“2.1.1”项下确定的色谱条件，进样测定，记录各样品的色谱图，并导出指纹图谱，将15批辛夷药材指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件中，以编号为S1样品（批号G1703052）的指纹图谱为参照图谱，以2号峰为Mark峰进行保留时间校正，同时进行全峰匹配，15批辛夷药材指纹图谱叠加图见图1，以平均数法生成辛夷药材对照指纹图谱，见图2。查阅相关文献报道[9]，以及与对照品的保留时间进行比对，并结合紫外吸收光谱图，确定峰2为木兰花碱，峰5为松脂素二甲醚，峰6为木兰脂素。由于木兰脂素为辛夷的主要有效成分之一，对照品易得，并且该成分色谱峰面积最大，分离度较好，因此选择木兰脂素色谱峰为参照峰，标定出10个共有指纹峰，计算各指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，各指纹峰的相对保留时间RSD值在0.05%～1.39%，相对峰面积RSD值在14.86%～107.18%，结果见表2、3。以辛夷对照药材为参照，辛夷药材样品指纹图谱的10个共有指纹峰与对照药材色谱中相应的色谱峰能够一一对应，说明15批辛夷药材与对照药材基原的一致性，10个共有指纹峰能很好地表征辛夷药材的特征。

2.1.9 相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”计算15批辛夷药材指纹图谱的相似度（表4），结果显示，以省划分产区，同一产区的辛夷药材指纹图谱的相似度值均大于0.90，不同的产区的四川和湖北2地采集的辛夷药材，指纹图谱的相似度也大于0.90，但与河南产区药材的相似度只有0.585～0.793，说明四川、湖北的辛夷药材在化学成分上与河南存在较大的差异。

2-木兰花碱 5-松脂素二甲醚 6-木兰脂素

2-木兰花碱 5-松脂素二甲醚 6-木兰脂素

2.1.10 聚类分析 使用SPSS 20.0软件，以10个共有指纹峰的峰面积为变量，采用Z得分法进行数据标准化处理，以组间联接法进行系统聚类，结果见图3，15批辛夷药材被聚成3类，湖北、四川和河南3个产区的辛夷药材各自聚为一类，分类结果明显与药材产地密切相关，聚类分析的结果与指纹图谱的相似度计算结果相似。

2.1.11 主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA） 采用SIMCA14.1软件，以10个共有指纹峰峰面积积分值为变量进行PCA，共生成5个主成分，累积贡献率达到99.5%，其中前2个主成分累积贡献率达到81.2%，Q2为0.919，证明模型有效。以PCA得分和峰面积变量得到Scores图和Loading图（图4、5），结果显示，湖北、四川和河南3个产区的药材分别聚集在3个不同的区域，得到较好地区分，说明不同产地辛夷药材化学成分具有较大差异。根据变量离原点的距离判断变量对主成分的影响权重，距离原点越远，变量对主成分的影响权重越大，分析变量对主成分1的影响权重大小依次为峰4、9、8、木兰脂素和松脂素二甲醚，变量对主成分2的影响权重大小依次为峰10、1、3。根据PCA分析结果，将湖北、四川和河南3个产区的药材分3组，以10个共有指纹峰峰面积积分值为变量进行OPLS-DA分析，得到10个变量的VIP图（图6），以VIP＞1.0为显著影响，共找到7个差异标志物，对其影响显著性排序，分别为木兰脂素＞峰4＞松脂素二甲醚＞峰3＞峰8＞峰9＞峰10，说明不同产区的辛夷药材木兰脂素和松脂素二甲醚的含量存在显著差异。

表2 15批辛夷药材指纹图谱共有峰的相对保留时间

表3 15批辛夷药材指纹图谱共有峰的相对峰面积

表4 15批辛夷药材相似度

图3 系统聚类树状图

图4 15批辛夷药材Scores图

图5 辛夷药材色谱峰变量Loading图

图6 辛夷药材VIP图

2.2 有效成分的测定

2.2.1 线性关系考察 取松脂素二甲醚、木兰脂素及木兰花碱对照品适量，精密称定，加50%乙醇制成含对照品松脂素二甲醚1 010.54 μg/mL，木兰脂素1 439.281 μg/mL，木兰花碱739.753 μg/mL的混合对照品储备液。精密移取混合对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.5、2.5、5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，摇匀，得到分别含松脂素二甲醚10.105、20.211、50.527、151.581、252.635、505.270 μg/mL，木兰脂素14.393、28.786、57.571、143.928、431.784、719.641 μg/mL、木兰花碱7.398、14.795、36.988、110.963、184.938、369.877 μg/mL的系列对照品溶液，分别精密吸取上述6个不同质量浓度的对照品溶液各1 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以色谱峰峰面积为纵坐标（），对照品质量浓度为横坐标（）进行线性回归，绘制标准曲线，3种成分的线性回归方程和线性范围见表5。

2.2.2 精密度试验 取“2.1.4”项下供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱方法连续进样6次，记录松脂素二甲醚、木兰脂素和木兰花碱的峰面积，并计算松脂素二甲醚、木兰脂素和木兰花碱峰面积RSD值分别为0.57%、0.68%、0.29%，结果表明仪器精密度良好。

表5 3种成分的线性回归方程及线性范围

2.2.3 稳定性试验 取“2.1.4”项下供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样分析，记录松脂素二甲醚、木兰脂素和木兰花碱的峰面积，并计算不同时间点松脂素二甲醚、木兰脂素和木兰花碱峰面积RSD值，分别为0.81%、1.26%、0.95%。

2.2.4 重复性试验 取同批次辛夷药材粉末，按“2.1.4”项下确定的供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算松脂素二甲醚、木兰脂素、木兰花碱的质量分数分别为20.02、50.10、4.92 mg/g，RSD值分别为1.52%、0.27%和1.95%，说明该方法重复性良好。

2.2.5 加样回收率试验 取辛夷药材粉末（批号G1703182，过二号筛）约0.1 g，精密称定，按样品与对照品松脂素二甲醚、木兰脂素、木兰花碱的含量比为1∶0.5、1∶1及1∶1.5加入松脂素二甲醚、木兰脂素、木兰花碱对照品，每种比例平行3份，按“2.1.4”项下方法制备9份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算3种成分的回收率范围及RSD值，松脂素二甲醚、木兰脂素和木兰花碱的加样回收率分别为95.20%～99.71%、95.94%～101.99%、90.42%～99.65%，平均加样回收率分别为98.16%、99.42%、96.99%，RSD分别为1.60%、2.15%、和3.00%，均小于4.0%，表明该分析方法准确度良好。

2.2.6 中间精密度试验 由本项目组其他分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，取同一批辛夷药材粉末（过二号筛）约0.2 g，精密称定，平行6份，按“2.1.4”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算松脂素二甲醚、木兰脂素、木兰花碱的质量分数分别为20.18、50.87、4.99 mg/g，与6份重复性试验样品的RSD分别为0.56%、1.27%和1.69%，表明该方法中间精密度良好。

2.2.7 样品测定 取15批辛夷药材粉末，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，按外标法计算各批次样品松脂素二甲醚、木兰脂素和木兰花碱的含量，结果见表6，15批辛夷药材松脂素二甲醚、木兰脂素和木兰花碱的总量在1.71%～8.02%。

表6 样品测定结果(n＝15)

《中国药典》2015年版辛夷药材项下规定木兰脂素的含量应不低于0.40%，15批样品均符合药典的规定，其中湖北产地的3批药材木兰脂素的含量是药典限度的3～4倍，河南产地的9批药材木兰脂素的含量是药典限度的6～14倍，四川产地的3批药材木兰脂素的含量是药典限度的2～3倍，此外，木兰花碱的含量以湖北最高，松脂素二甲醚的含量以河南最高，3种有效成分的总含量，以河南最高，分别为湖北的2～3倍，四川的3～5倍。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

与HPLC相比，UPLC法因分辨率高、分离能力强、分析时间缩短，在中药指纹/特征图谱的建立方面优势明显[10]。本实验采用UPLC谱，在45 min内，即完成主要色谱峰的良好分离，其中松脂素二甲醚、木兰脂素和木兰花碱3种有效成分的分离度和峰纯度符合定量要求，3种化合物均在230 nm附近有最大吸收，且指纹图谱研究发现，230 nm处色谱峰数目较多，响应值较大，基线平稳，因此选择230 nm作为指纹图谱和含量测定的检测波长。流动相的筛选考察了甲醇-0.1%磷酸溶液，乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-水3种溶剂系统的洗脱和分离效果，结果显示，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，各色谱峰出峰时间短，分离度较好。色谱柱的选择，分别考察了YMC Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）色谱柱、Waters HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱、Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱和Waters Cortecs T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）色谱柱这4种不同品牌和柱填料的柱子对指纹图谱和含量测定各色谱峰的分离效果，结果显示，采用YMC Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）柱，各色谱峰分离效果最佳。

3.2 供试品溶液制备方法考察

在方法的建立过程中，分别对不同的提取溶剂（甲醇、50%甲醇、30%甲醇和50%乙醇）、提取方式（超声、回流）、提取时间（30、45、60 min）进行考察，以各色谱峰的总峰面积/称样量以及3种有效成分的含量为考察指标，优选最佳的提取方法，结果显示，以50%乙醇超声提取45 min，提取效率最高。

3.3 指纹图谱的构建及分析评价

辛夷（望春花Pamp.）为落叶乔木，生于海拔400～2400 m的山坡林中，多为家种，野生资源较少，主要分布于河南、湖北及四川等地[11]，15批辛夷药材指纹图谱共标识出10个共有指纹峰，通过对照品指认出3个有效成分，分别为木兰脂素、松脂素二甲醚和木兰花碱。相似度评价结果显示，同省区的药材，相似度较高，不同的省区，湖北、四川与河南存在明显的差异，HCA和PCA分析将15批药材分为3类，并对应不同的产区，OPLS-DA分析找到7个差异标志物，说明不同产区辛夷药材的化学成分存在较大差异，这种差异可能与药材的生长环境、采收加工等因素密切相关。

3.4 有效成分的测定与分析

15批药材3种有效成分的测定结果显示，木兰脂素和木兰花碱的含量，河南均明显高于湖北与四川，木兰脂素的含量更是药典限度的6～14倍，而湖北辛夷木兰花碱的含量最高，且3批药材木兰花碱的含量较稳定。《中国药典》2015年版辛夷药材项下以木兰脂素为含测指标，但是单一的成分测定，尚不足以全面评价辛夷药材的质量。中药成分复杂，针对不同的功能主治，发挥作用的有效成分不同，因此，有必要增加多指标的含量测定，并根据发挥作用的药效物质不同，选择合适的药材产地。本文在指纹图谱的基础上，增加对有效成分木兰脂素、木兰花碱和松脂素二甲醚的同时测定，从多角度研究不同产地辛夷药材质量的差异性，该方法简便，专属性强，重复性良好，分析时间短，能有效地分析不同产地辛夷药材质量的差异性，为不同产地辛夷药材的质量评价提供参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Differences offrom different producing areas based on fingerprint and multi-components determination

LI Zhen-yu, HE Jia-ying, TONG Pei-zhen, WEI Mei, SUN Dong-mei, DENG Cong-you, CHEN Xiang-dong

Guangdong Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula Granule, Guangdong Yifong Pharmaceutical Co., Ltd., Foshan 528244, China

To evaluate the difference offrom different producing areas by establishing UPLC fingerprint and determining contents of three effective components of.UPLC method was adopted. The determination was performed on YMC Triart C18column (100 mm ×2.1 mm,1.9 μm) with acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution as the mobile phase by gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min. The detective wavelength was 230nm, the column temperature was 30 ℃, the injection volume was 1μL. The UPLC fingerprints of 15 batches ofwere established and the common peaks were identificated by reference substances. The contents of three effective components were determined. Similarity evaluation, cluster analysis (HCA), and principal component analysis (PCA) were carried out on the fingerprints and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) was used to find the different components offrom different producing areas.There were 10 common peaks in the fingerprints of. By comparing with the reference substances, three common peaks were identified, namely, magnolin, pinoresinol dimethyl ether, and magnolflorine. The similarity among Hubei, Sichuan and Henan was 0.585—0.793. According to the analysis of HCA and PCA, 15 batches ofwere divided into three categories, corresponding to three different producing areas. Seven kinds of biomarkers were determined by OPLS-DA method. The order of significance was magnolin > peak 4 >pinoresinol dimethyl ether > peak 3 > peak 8 > peak 9> peak 10, respectively. The contents of magnolin and pinoresinol dimethyl ether inof Henan Province were the highest and the content of magnolflorine inof Hubei Province was the highest.This method can effectively analyze the quality differences offrom different producing areas and provide reference for the quality evaluation.

; UPLC fingerprints; multi-components determination; differential marker; magnolin; pinoresinol dimethyl ether

R286

A

0253 - 2670(2021)01 - 0234 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.028

2020-05-10

广东省省级科技计划项目（2018B030323004）

李振雨（1989—），主管中药师，从事中药饮片及中药配方颗粒研究。

陈向东，高级工程师，从事中药饮片及中药配方颗粒研究。E-mail: 1083656123@qq.com

[责任编辑 时圣明]