ADAMTS13在动脉粥样硬化中的作用*

李华，李鸿雁，金圣宇**

(1.延边大学附属医院 体检科，吉林 延吉 133000； 2.延边大学附属医院 血液内科，吉林 延吉 133000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要原因、以动脉血管壁白细胞浸润为特征的慢性炎性疾病[1-2]，目前AS的发病机制尚未完全清楚。超大血管性血友病因子(ultra large-von willebrand factor, UL-VWF)参与AS斑块破裂部位的血栓形成，主要通过PSGL-1、β2-整联蛋白介导白细胞的滚动和黏附，在AS形成过程中加速炎症反应。VWF是血管性血友病因子裂解酶13(adisintegr in and metall oproteinase with a thrombospond in type 1 motif，member 13，ADAMTS13)的唯一底物[3]，ADAMTS13缺乏(Adamts13-/-)的急性炎症小鼠模型[4]可导致白细胞在正常静脉中滚动增加，使其在炎症静脉中黏附增加，可促进白细胞在高剪切力作用下的捕获和滚动。血小板可能通过GpIbα受体与受损内皮表面的VWF依赖性相互作用、并释放炎症因子促成AS进程，故ADAMTS13可能通过裂解UL-VWF调节炎症反应[3,5]。GpIbα主要作用是与VWF结合引起血小板黏附，进而改变细胞骨架，使血小板发生变形、移动、分泌、聚集和收缩等一系列变化。近年来的研究发现，ADAMTS13功能异常与许多心脑血管疾病相关，如急性心肌梗死[6-8]、缺血性脑卒中[9-11]等，然而ADAMTS13水平降低、或VWF水平失衡是否参与此类疾病发生发展中的机制尚不明确。因此本研究使用载脂蛋白E缺乏(ApoE-/-)小鼠和Adamts13基因敲除的载脂蛋白E缺乏(Adamts13-/-ApoE-/-)小鼠，高脂肪饮食喂养12周，观察比较2组小鼠主动脉AS病变程度、分析血浆VWF多聚体水平及血脂水平变化，探讨ADAMTS13在AS发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1小鼠及食物 ApoE-/-小鼠(C57BL/6J品系)，从杰克逊实验室购买。Adamts13-/-小鼠(C57BL/6/129品系)由戴维金斯伯格博士(内科学教研室，密歇根大学)提供。高脂肪的西方饮食购买自哈伦实验室，由21.2%的脂肪和0.2% 胆固醇组成。

1.1.2主要试剂和仪器 组织冰冻包埋剂(特德佩拉公司，美国)，Tris HCL(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，上海康朗，中国)，1%酪蛋白、兔抗-VWF IgG抗体、IRDyeCW800标记的山羊抗兔IgG抗体(Sigma,美国)，血脂分析市售试剂(Wako Pure Chemical Industries and Trinity Biotech)，微型台式离心机 (Sigma，德国)，DYDW-60UL -80 ℃低温冰箱(鼎耀，中国)，SMZ1500高级体视显微镜、MIR-254低温恒温箱(松下，日本)，ECLIPSE-80i显微镜、DXM1200数码相机(Nikon，日本)，1.0% Seakem基因水平转移琼脂糖微型凝胶、HATF00010硝酸纤维素膜(Millipore，美国)，CHI600-E电化学分析仪(CH公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1动物繁殖 ApoE-/-小鼠和Adamts13-/-小鼠合笼4周，繁殖产出Adamts13-/-ApoE-/-小鼠，当小鼠达到6周龄时，开始予以高脂肪的西方饮食喂养，共喂养12周。

1.2.2血液采集 于喂养12周结束时，采用3.9%的枸橼酸钠抗凝后管采集禁食4 h后的小鼠球后眶窦丛中的全血(200 μL)，在微型离心机上以10 000 r/min离心10 min，并将获得的血浆存储在-80 ℃冰箱，用于分析血脂水平。

1.2.3主动脉AS病变染色 于喂养12周结束时，将小鼠(每组13只)处死，在解剖显微镜下，分离主动脉和心脏、用10%的中性福尔马林固定液浸泡；用油红O染色法及苏木精-伊红染色观察主动脉AS病变程度[12]，用NIH ImageJ软件进行量化分析。

1.2.4血浆VWF多聚体 向枸橼酸钠抗凝的血浆(0.1 μL)中加入70 mmol/L Tris HCL、2.4%十二烷基硫酸钠、4%尿素、4 mmol/L EDTA，在pH6.5、60 ℃条件下加热 20 min变性。变性后的样品放在1.0% Seakem 基因水平转移琼脂糖微型凝胶中，以15 mA电流行2.5 h凝胶电泳后进行样品分级。转移到硝酸纤维素膜上后，将膜用Tris HCL与酪蛋白(20 mmol/L Tris HCL，pH 7.5，150 mmol/L NaCl和1%酪蛋白)封闭30 min。将膜与兔抗-VWF IgG抗体放入三羟甲基氨基甲烷缓冲液与酪蛋白(1 ∶1 500)中，以4 ℃孵育过夜，然后将用IRDyeCW800标记的山羊抗兔IgG抗体放入三羟甲基氨基甲烷缓冲液与酪蛋白(1 ∶12 500)中孵育1 h。应用奥德赛成像系统(LI-COR)获得荧光标记信号。

1.2.5血脂分析 检测血浆总胆固醇、高密度脂蛋白和甘油三酯的水平。

1.3 统计学分析

数据使用Prism5 GraphPad 软件进行统计分析，所有数据均为独立重复3次后的结果。数据的两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 主动脉AS病变程度

油红O染色及苏木精-伊红染色结果均显示，与ApoE-/-小鼠比较，Adamts13-/-ApoE-/-小鼠的AS病变显著增加。图像分析结果显示，与ApoE-/-小鼠比较，Adamts13-/-ApoE-/-小鼠主动脉AS病变相对表面积增加约5.5倍，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

注：A、a、C为ApoE-/-小鼠，B、b、D为Adamts13-/- ApoE-/-小鼠，A、B箭头为小鼠主动脉AS区域，C、D箭头为AS区域(200×),a、b是A、B放大100倍的图像；(1)与ApoE-/-比较，P<0.01。图1 两组小鼠主动脉AS病变组织学观察和相对表面积测量图Fig.1 Histological observation and relative surface area measurement of aortic atherosclerosis between the two groups

2.2 VWF多聚体分析

图2A图结果显示，与ApoE-/-小鼠、或者野生型小鼠相比较，Adamts13-/-ApoE-/-和Adamts13-/-小鼠蛋白电泳条带主要集中在UL-VWF多聚体一侧。图2B结果显示，Adamts13-/-ApoE-/-小鼠UL-VWF与低分子量VWF多聚体比值与ApoE-/-小鼠、或者野生型小鼠的比值比较显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：A为Western blot电泳条带，B为灰度直条带；(1)与WT或ApoE-/-比较，P<0.01。图2 VWF多聚体在不同老鼠之间的分布Fig.2 Distribution of VWF polypolymers among different mice

2.3 血脂分析

2组小鼠血浆中总胆固醇、甘油三酯、非高密度脂蛋白水平在ApoE-/-和Adamts13-/-ApoE-/-小鼠中的差异无统计学有意义(P>0.05)，而Adamts13-/-ApoE-/-小鼠血浆高密度脂蛋白水平高于ApoE-/-小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 ApoE-/- 和Adamts13 -/-ApoE-/-小鼠血脂测定结果/(g/L)Tab.1 Plasma leves of serum lipid in ApoE-/- and Adamts13-/- ApoE-/- Mice/(g/L)

3 讨论

心血管疾病是全球死亡的主要原因，而AS则是心血管事件的主要因素。很多研究报道ADAMTS13与VWF异常是心脑血管疾病发生发展的危险因素。Masri等[12]分别检测了80例心肌梗死(AMI)患者入院时及入院的3～4 d后，36例3个月后随访患者的ADAMTS13及VWF水平，结果示VWF水平升高和ADAMTS13活性降低可能是AMI进展的关键因素。Schuppner等[13]做了一项前瞻性研究，纳入41例大血管阻塞导致急性脑卒中患者，在治疗前，症状发作后的第1、3、7、90天采集外周静脉血检测ADAMTS13水平，结果示ADAMTS13活性低是接受治疗的缺血性脑卒中患者预后不良的指标。Putzer等[14]纳入了重组组织纤溶酶原激活物的静脉溶栓(IVT)治疗后的43例急性缺血性中风患者，分别于治疗前及症状发作后第1、3、7、90天检测了血中ADAMTS13的活性并评估了早期神经功能，结果示ADAMTS13活性与静脉溶栓治疗的急性缺血性中风患者的早期神经功能改善相关。由此可见ADAMTS13在AS病变发生中可能起着作用，但其作用机制尚不明确。本研究结果显示，与ApoE-/-小鼠比较，Adamts13-/-ApoE-/-小鼠的AS病变的形成显著增加。提示Adamts13-/-ApoE-/-小鼠主动脉有更广泛、更大面积的AS病变形成。证明ADAMTS13在遗传易感性小鼠免于形成早期AS病变中起着至关重要的作用。

但本研究仍不能明确ADAMTS13保护ApoE-/-小鼠免于形成早期AS病变的机制，所以提出假设，血浆中ADAMTS13活性缺乏会导致内皮细胞表面和血浆中UL-VWF多聚体的累积，同时也增加了血小板的黏附、聚集，血栓形成和全身炎症反应。为了判断是否ApoE的缺乏加上高脂肪西方饮食喂养会进一步破坏了VWF的内稳态。本研究通过琼脂糖凝胶电泳的方法描述血浆中VWF多聚体的分布。结果证明了敲除Adamts13基因会导致UL-VWF在血浆中的积累，但是ApoE基因缺失加上高脂肪西方饮食的喂养并没有进一步破坏VWF的内稳态。VWF是至今为止被发现的唯一可以被ADAMTS13识别的底物，这也提示ADAMTS13可能通过降解UL-VWF，抑制AS病变形成。研究发现，在给予LDLR-/-VWF+/+和 LDLR-/-VWF-/-小鼠富含饱和脂肪和胆固醇的饮食，在高脂饮食8周后，在任何性别的LDLR-/-VWF-/-小鼠的主动脉窦中形成的脂肪条纹比LDLR-/-VWF+/+小鼠中的脂肪条带少40%，招募的单核细胞也较少；而高脂饮食22周后(纤维斑块早期阶段)，在主动脉窦处病变大小的差异依然存在。VWF和白细胞之间的互相作用主要是通过内皮细胞表面的VWF与白细胞P-选择蛋白糖蛋白配体-1[15-16]，P-选择蛋白，L-选择蛋白[17-18]的相互联系而被调节。P-选择蛋白糖蛋白配体-1-/-小鼠在白细胞募集进入AS动脉壁时表现出选择性损伤。抑制P-选择蛋白完全消除了Adamts13-/-小鼠中的白细胞滚动，表明即使在存在内皮VWF链的情况下也需要P-选择蛋白开启白细胞滚动。血小板黏附时连接GPIb-IX-V复合体可能导致血小板整合素GPⅡb-Ⅲa激活和血小板抗剪切力沉积。随后由外向内的信号传导使细胞质Ca2+含量增加，导致颗粒分泌和黏附在血小板周围强效炎症介质释放而促进AS的发展。在ApoE-/-小鼠中应用血小板粘附抑制剂(Pop/B)抑制VWF与GPⅠbα的结合，防止活体小鼠的血小板黏附，导致白细胞在动脉内膜极度减少，颈动脉分叉处、主动脉窦、冠状动脉AS形成减少。证明VWF和血小板在促进全身及局部炎症反应和AS病变发生和发展中发挥作用[19-20]。这些数据提示在Adamts13-/-ApoE-/-小鼠中炎症反应的增加可能促进AS斑块的形成。VWF、血小板、白细胞在早期AS病变发生中均起作用。

同时为了排除ADAMTS13蛋白酶解作用在胆固醇代谢中的潜在影响，用高脂肪西方饮食饲养12周后，测定了各组老鼠血浆中的总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇，非高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯数值。结果显示，血浆中总胆固醇、非高密度脂蛋白胆固醇，和甘油三酯的水平在Adamts13-/-ApoE-/-小鼠和ApoE-/-小鼠中没有显著性差异，然而Adamts13-/-ApoE-/-小鼠血浆高密度脂蛋白胆固醇的水平高于ApoE-/-小鼠，这种差异具有统计学意义。在Adamts13-/-ApoE-/-小鼠中，HDL水平升高的作用机制尚未明确。在2组血脂的测定中只有高密度脂蛋白胆固醇的水平在Adamts13-/-ApoE-/-小鼠中是增加的，这表明了AS病变发病量的增加，不是因为胆固醇代谢异常的结果，而是ADAMTS13缺乏的直接影响结果。

综上，ADAMTS13可能通过降解UL-VWF多聚体，抑制血小板聚集和炎症反应，从而减慢AS发展中的进程。