钙结合蛋白S100A4对鸡卵清白蛋白诱导的免疫应答作用*

吴通前，马岚，金筱茜，周萍萍，李静，袁锐，余芳***

(1.贵州医科大学附属医院 临床研究中心，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 医学检验学院 临床微生物及免疫学教研室，贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学附属医院 临床检验中心，贵州 贵阳 550004； 4.湖北医科大学附属东风医院 临床检验中心，湖北 十堰 442008； 5.长沙市第八医院 临床检验中心，湖南 长沙 410100)

免疫佐剂(immunologic adjuvant)是一类能非特异性增强或改变机体对匹配抗原的特异性免疫应答，可以增强抗原的免疫原性或者改变免疫的反应类型，但其本身并无抗原性的一类物质[1]。佐剂种类很多，如氢氧化铝佐剂、细菌佐剂、脂多糖及细胞因子等[2-3]。免疫佐剂可广泛结合多种疫苗使用，通过不同机制降低抗原的使用量，迅速激活免疫系统增强免疫应答、延长释放时间，对提升疫苗免疫效果具有非常重要的价值[4]。近期研究显示，免疫佐剂已广泛在肿瘤、过敏性疾病及自身免疫性疾病等多种疾病中开展了相关研究[5-7]。研究证实，钙结合蛋白S100A4通过Toll样受体4(toll-like receptors 4，TLR4)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)及细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)等信号通路在血管生成、肿瘤细胞存活迁移、蛋白磷酸化以及促进炎症等方面起到重要的调控作用[8-11]。S100A4的缺乏会削弱霍乱毒素(cholera toxin,CT)的佐剂作用，并抑制树突状细胞(dendritic cell,DC)的增殖及活化，同时还抑制炎性因子γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)以及白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)的产生，提示S100A4在机体细胞免疫应答的潜在积极作用[12]。但目前尚没有证据表明S100A4在免疫佐剂领域存在的潜在作用，基于此，本研究通过鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)为模式抗原，以S100A4为佐剂免疫小鼠，探究S100A4的佐剂潜在作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 8～10周龄野生型(wild-type,WT)健康雌性C57BL/6小鼠10只，购于自北京华富康生物科技有限公司。小鼠于本校临床医学研究中心无特定病原体(specific pathogen free，SPF)动物实验室饲养，动物实验方案经本校动物保护委员会伦理指导批准(批准号1503057)。

1.1.2主要试剂及仪器 用于购建重组小鼠的S100A4蛋白购于英国Abcam公司，OVA购自美国SIGMA公司，4-硝基苯磷酸二钠(para-nitrophenyl phosphate,pNPP)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)底物、碱性磷酸酶-山羊抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)及免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)抗体购于美国Southern Biotech公司，抗小鼠白细胞分化簇3(cluster of differentiation 3，CD3)FITC抗体、抗小鼠白细胞分化簇69(cluster of differentiation 69，CD69)PE抗体、抗小鼠白细胞分化簇11c(cluster of differentiation 11c，CD11c)APC抗体及抗小鼠主要组织相容性抗原Ⅱ类分子(major histocompatibility antigen Ⅱ, MHC-Ⅱ)V500抗体购自于美国BD公司，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)购自美国Gibco公司；NAVIOS流式细胞仪购自美国Beckman公司，SYNERGY多功能酶标仪购置美国Bio Tek公司。

1.2 方法

1.2.1分组及采样 小鼠随机分为OVA组(OVA 20 μg)与OVA联合S100A4蛋白组(OVA 20 μg与S00A4蛋白5 μg的混合液，联合组)，每组5只，所有小鼠均经踝关节免疫注射，2周后摘除眼球收集外周血，1 000 r/min离心5 min收集血清做后续实验；颈部折断处死小鼠，收集距离免疫部位最近的腹股沟淋巴结(即引流淋巴结)做后续实验。

1.2.2流式细胞术检测引流淋巴结T细胞、树突状细胞(dendritic cells,DC)及其活化 取各组小鼠引流淋巴结并研磨碎，制备单细胞悬液200 μL；吸取悬液50 μL至流式上样管中，分别加入抗小鼠CD3 FITC抗体、抗小鼠CD69 PE抗体、抗小鼠CD11c APC抗体及抗小鼠MHC-Ⅱ V500各1 μL至含有样本的流式上样管中，4 ℃避光孵育25 min，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，去上清，加PBS 400 μL重悬各样本管中细胞；流式细胞仪上机分析，CD3+细胞群为T细胞，CD11c+细胞群为DC，CD3+CD69+双阳性细胞群为活化T细胞，CD11c+MHC-Ⅱ+双阳性细胞群为活化DC。

1.2.3ELISA检测血清OVA特异性IgG及IgE 取2块酶标板，先将200 μg/L OVA 加到96孔酶标板中，4 ℃过夜，PBS洗涤4次；加1%BSA溶液4 ℃封闭过夜，PBS洗涤4次，拍干备用；取2组小鼠血清经3倍逐级稀释后取60 μL分别加入至已经制备好的2块酶标板中第1排，3倍体积梯度稀释至最后一排，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤4次；向其中一块板各样本孔中加入碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)标记的羊抗鼠IgG抗体(1 ∶3 000稀释) 60 μL，另一块板各样本孔中加入碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)标记的羊抗鼠IgE抗体(1 ∶3 000稀释)60 μL，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤4次；加入4-硝基苯磷酸二钠(para-nitrophenyl phosphate,pNPP)底物避光显色15～30 min；加入终止液，酶标仪检测405 nm处吸光度值(optical density,OD)，据不同梯度浓度检测出的OD值计算OVA特异性IgG与IgE水平[13]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 引流淋巴结T细胞、DC及其活化

流式细胞术检测结果显示，联合组小鼠引流淋巴结中T细胞(CD3+)和DC(CD11c+)百分比高于OVA组，差异均有统计学意义(P<0.05)；联合组小鼠引流淋巴结活化T细胞(CD3+CD69+)和活化DC(CD11c+MHC-Ⅱ+)百分比也高于OVA组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A为引流淋巴结T细胞、DC及其活化流式细胞术检测结果，B为引流淋巴结T细胞、DC及其活化百分比结果；(1)与OVA组比较，P<0.05。图1 两组小鼠引流淋巴结中T细胞、DC及其活化检测Fig.1 Detection of T cells, DC, and their activation in draining lymph nodes between the two groups

2.2 血清OVA特异性IgG和IgE水平

ELISA检测结果显示，联合组小鼠血清中OVA特异性IgG明显高于OVA组，差异有统计学意义(P<0.01)；联合组小鼠血清中OVA特异性IgE与OVA组的差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：(1)与OVA组比较，P<0.01。图2 两组小鼠血清OVA特异性IgG及IgE检测Fig.2 Measurement of serum OVA-specific IgG and IgE between the two groups

3 讨论

S100A4在肿瘤转移研究领域广泛被研究，除在多数肿瘤细胞中表达外，还广泛表达于机体免疫细胞，如T细胞、DC细胞及单核细胞等，并涉及参与调节这些免疫细胞的免疫功能，从而参与免疫调控[14]。本研究以OVA作为外源性抗原，雌性小鼠在相关疾病模型研究中发病率高于雄性小鼠，如过敏性哮喘[15]、自身免疫性疾病[16]等，因而本研究以C57BL/6雌性小鼠为研究对象，观察S100A4作为免疫佐剂在机体免疫应答的中的作用。足底免疫是用于研究体内及体外免疫应答现象的常用注射部位，是一种用于测定体内免疫反应的灵敏、快速而简单的测定方法[17]。当抗原通过足部进入机体时引起就近淋巴结引流，并引起淋巴结内部免疫细胞活化增殖，发挥抗原提呈及加工功能，刺激机体产生免疫应答[18]。已有研究表明，踝关节免疫与足底免疫效果一致，具有较高灵敏度，并不影响机体的免疫反应[19]。因此，本实验没有采用传统的足底免疫法，而是通过踝关节注射进行免疫，就是考虑到相对于足底免疫法，踝关节注射更为人性化，可以提高小鼠生活满意度且不影响其行动能力。

研究显示，S100A4基因敲除后可有效抑制OVA诱导的过敏免疫应答，并抑制了引流淋巴结中CD4+、CD8+和CD11c+细胞的增殖及血清中IgG和IgE水平，提示S100A4在免疫应答中的调节作用及潜在的免疫佐剂作用[20]。细胞免疫是机体产生免疫应答的重要过程，抗原提呈细胞(如DC，单核巨噬细胞)及T细胞活化增殖过程中发挥着主要作用[21]。本研究将OVA作为诱导免疫反应的抗原，S100A4蛋白为免疫佐剂免疫小鼠，结果表明与OVA组相比，联合组小鼠引流淋巴结中T细胞(CD3+)与DC (CDc11+)百分比升高(P<0.05)，提示S100A4蛋白能够促进OVA诱导的小鼠局部引流淋巴结产生更多的T细胞及DC。CD69是T细胞激活的免疫调节分子，可通过T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)刺激后，在成熟T细胞上迅速诱导CD69的表达，10%正常胸腺细胞中均表达，是T细胞初始活化的首要调节分子[22]。本实验研究中，通过流式细胞术进一步检测OVA组及联合组中引流淋巴结T细胞的活化情况，结果显示联合组引流淋巴结中活化T细胞(CD3+CD69+)百分比高于OVA组(P<0.05)，表明S100A4的存在促进了T细胞活化。MHC-Ⅱ是主要表达于抗原提呈细胞上的免疫调节分子，如DC、单核巨噬细胞等，是抗原提呈细胞发挥抗原提呈功能的主要活化分子[23]。外源性抗原进入机体后通过MCHⅡ递呈给T细胞，从而产生细胞免疫应答[24]。DC是机体最主要的抗原提呈细胞，其增殖活化是初始免疫应答的关键[25]，在本研究中联合组引流淋巴结中活化DC (CD11c+MHC-Ⅱ+)百分比高于OVA组(P<0.05)，提示S100A4作为佐剂可以促进DC的活化，证实了其在诱导局部免疫应答中的积极作用。

细胞免疫是T细胞介导的免疫应答，即T细胞受到抗原刺激后，分化、增殖活化对抗原直接进行杀伤，并释放相关细胞因子，如白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素4 (interleukin-4,IL-4)、白细胞介素5(interleukin-5,IL-5)、白细胞介素13(interleukin-13,IL-13)等，该类细胞因子作用于B细胞促使其增殖活化，并释放特异性抗体，如抗原特异性IgE、IgG及其亚型，从而引起体液免疫[26]。血清学分析结果表明，联合组小鼠血清IgG水平高于OVA组(P<0.05)，证实S100A4在OVA诱导的体液免疫中的积极作用。抗原进入机体后诱导体液免疫，促使B细胞活化产生IgE，并与肥大细胞、嗜碱性粒细胞等细胞上Fc ε受体I(Fc epsilon receptor I，FcεRI)白细胞分化簇23(cluster of differentiation 23，CD23)受体结合诱导过敏反应[27]。本实验结果表明，OVA组与联合组小鼠血清IgE滴度水平差异无统计学意义(P>0.05)，提示S100A4作为免疫佐剂在诱发过敏安全性的潜在意义。

综上所述，经OVA诱导的小鼠免疫反应后，S100A4蛋白可促进引流淋巴结T细胞、DC及其活化百分比，同时促进血清中IgG的产生，提示S100A4蛋白作为免疫佐剂增强了OVA诱导的免疫应答，在免疫佐剂研究领域具有一定的潜在作用。