钙蛋白酶抑制剂对雌激素诱导人乳腺癌细胞上皮-间质转化的影响*

金爱，王宏键，董宇华，王旭东

(贵州医科大学 基础医学院 生理学教研室，贵州 贵阳 550025)

乳腺癌(breast cancer)是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，也是女性最常见的激素依赖性恶性肿瘤，严重威胁着患者的身心健康[1-2]。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一种生物学过程，可通过相应信号机制使上皮细胞转化为间质表型的细胞[3]，EMT过程中的恶性肿瘤细胞往往可以获得迁移和侵袭能力[3]，迁移和侵袭能力增强是乳腺癌转移的必要条件[4]，亦提示有效抑制EMT可能是遏制乳腺癌转移的关键。17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)是女性体内重要的性激素之一，正常生理状态下，E2能调节乳腺的生长发育；而在恶性肿瘤中，E2可参与诱导多种肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移及侵袭等生物学行为[5-6]；此外，E2还可诱导乳腺癌细胞发生EMT[7-8]。钙蛋白酶(calpain)是一类依赖于Ca2+激活的中性蛋白酶超家族，其成员通过对底物进行“有限”切割，从而调整底物活性、并调节细胞生物学行为，如增殖、侵袭、迁移、骨架重构等[9]。本课题组前期研究结果显示，E2可通过钙蛋白酶诱导乳腺癌MDA-MB-468细胞迁移[10]。然而，关于钙蛋白酶是否介导E2诱导的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞EMT和迁移目前尚不明了。因此，本研究通过分子生物学实验深入探究钙蛋白酶在E2诱导乳腺癌细胞迁移过程中的作用以及对EMT标志物纤连蛋白(fibronectin，FN)和E-钙黏素(E-cadherin)蛋白表达的影响，为临床治疗乳腺癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验细胞与主要试剂 人雌激素受体(estrogen receptor，ER)阴性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和ER阳性的乳腺癌细胞系MCF-7(中国科学院上海细胞库)，改良Eagle培养基(dulbecco’s modification of Eagle's medium，DMEM)、RPMI-1640培养基、抗生素(penicillin and streptomycin，美国Hyclone 公司)，胎牛血清(fetal calf serum，FBS；杭州四季青公司)，E2和钙蛋白酶抑制剂(calpeptin，美国Sigma公司)，蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF；武汉博士德生物)，抗FN多克隆抗体(美国Abcam公司)，羊抗小鼠IgG-HRP和羊抗小兔IgG-HRP(美国Santa Cruz公司)，抗E-cadherin多克隆抗体、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗体(南京Bioworld公司)及蛋白浓度测试试剂盒(上海碧云天公司)。

1.1.2主要仪器 恒温CO2培养箱(美国Thermo公司)，SW-CJ-2FD超净工作台(中国苏州净化)，台式超低温高速离心机(美国Beckman Couler公司)，CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司)及恒温培养震荡器(中国智城分析公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 MCF-7乳腺癌细胞培养于10%FBS、1%抗生素及89%RPMI-1640培养基中，MDA-MB-231乳腺癌细胞培养于10%FBS、1%抗生素及89%DMEM培养基中，所有细胞均培养于37 ℃、5%CO2及饱和湿度(95%)培养箱。细胞培养24 h至对数生长期，用于后续实验。

1.2.2划痕实验检测细胞迁移能力 取对数期生长的MCF-7和MDA-MB-231模型细胞分别铺于12孔板，全培养基培养细胞至90%～100%，换无血清培养基同步化24 h，20 μL的无菌枪头在12孔板皿底作十字划痕，PBS清洗；分别加DMSO(对照组)、50 nmol/L E2(E2组)及50 nmol/L E2联合10 μmol/L Calpeptin(E2+Calpeptin组)处理模型细胞，0、12、24 和48 h时标记区域进行拍照，记录细胞划痕区域宽度，计算细胞迁移率[细胞迁移率=(0 h划痕宽度-12 h或24 h或48 h划痕宽度)/ 0 h划痕宽度×100%][11]。

1.2.3蛋白印记实验检测模型细胞FN和E-cadherin表达变化 将对数期生长的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌模型细胞分别铺于6孔板中，次日更换无血清培养基同步化24 h，待细胞汇合度达70%，分别加DMSO(对照组)、50 nmol/L E2(E2组)及50 nmol/L E2联合10 μmol/L Calpeptin(E2+Calpeptin组)处理模型细胞，提取蛋白，配制含1 mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA细胞裂解液于冰盒中裂解20 min，4 ℃离心机12 000 r/min离心15 min，吸取上清液至标记好的EP管进行蛋白定量；10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白(30 μg/泳道)，湿转法将分离的蛋白转印至硝酸纤维膜；5%牛血清白蛋白室温封闭1～2 h，TBST洗膜3次/10 min，然后加入抗FN多克隆抗体(1 ∶1 000)、抗E-cadherin多克隆抗体 (1 ∶1 000)室温孵育2 h；TBST洗膜3次/10 min，加入相应二抗(1 ∶4 000)室温孵育1 h，用凝胶成像仪进行成像拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞迁移

与对照组相比，E2组MCF-7乳腺癌细胞24 h和48 h迁移率均有明显增加，差异均有高度统计学意义(P<0.01)；与对照组相比，E2组MDA-MB-231乳腺癌细胞24 h和48 h迁移均有明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

注：A、C为划痕实验结果(40×)，B、D为细胞迁移率的条图；(1)与同时点对照组比较，P<0.01。图1 E2诱导MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌细胞的迁移能力Fig.1 Migration of MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells induced by E2

2.2 E2诱导的乳腺癌细胞E-cadherin和FN的表达

在MCF-7细胞中，与0 h相比，E2组细胞FN的表达在24 、48 和72 h均明显上调，E-cadherin的表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)，其中48 h效果最佳；在MDA-MB-231细胞中，与0 h相比，E2组细胞FN的表达在24、48和72 h均明显上调，E-cadherin的表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)，其中48 h效果最佳。见图2。

注：A、C为Western blot实验结果，B、D为相关蛋白定量表达的条图；(1)与0 h比较，P<0.01。图2 E2诱导MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌细胞的FN及E-cadherin蛋白表达Fig.2 Expression of FN and E-cadherin proteins in MCF7 and MDA-MB-231 human breast cancer cells induced by E2

2.3 Calpeptin抑制E2诱导的乳腺癌细胞迁移

与E2组相比，E2+Calpeptin组MCF-7细胞的24 h和48 h迁移率均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与E2组相比，E2+Calpeptin组MDA-MB-231细胞的24 h迁移率降低，48 h迁移率降低，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图3。

注：A、C为划痕实验染色结果(40×)，B、D为细胞迁移率的条图；与同时点E2组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01。图3 Calpeptin抑制E2诱导MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌细胞的迁移能力Fig.3 Migration of MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells induced by calpeptin-inhibited E2

2.4 Calpeptin抑制E2诱导的模型细胞E-cad和FN的表达

在MCF-7细胞，与E2组相比，E2+Calpeptin组FN表达显著下调, E-cad表达显著上调，差异均有统计学意义(P<0.01)；在MDA-MB-231细胞，与E2组相比，E2+Calpeptin组FN明显表达下调，E-cadherin表达明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

注：A、C为Western blot实验结果，B、D为相关蛋白定量表达的条图；(1)与E2组比较，P<0.01。图4 Calpeptin抑制E2诱导MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌细胞的FN和E-cadherin蛋白表达Fig.4 Expression of FN and E-cadherin in MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells induced by calpeptin-inhibited E2

3 讨论

本实验结果发现，与对照组相比，E2处理组MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞在24和48 h的迁移率均明显增加，细胞中FN蛋白在24、48和72 h表达均明显上调，而E-cadherin蛋白表达则明显下调；与E2组相比，E2+Calpeptin组MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移率明显下降，FN表达明显减少，E-cadherin表达明显增加。因此提示Calpain在E2介导的乳腺癌细胞迁移和EMT过程中发挥着重要的作用。

乳腺癌是常见的恶性肿瘤，是女性肿瘤相关性死亡的最常见原因，全球每年大约有138万的新发病例，每年约45.8万死于乳腺癌疾病[12]。尽管随着治疗水平的提高，乳腺癌的致死率每年逐渐下降，但致死率仍在15%以上[13]。乳腺癌严重危害女性的健康，因此乳腺癌的防治是当今研究者最迫切关注的问题。

乳腺癌是经典的激素依赖性的恶性肿瘤，许多研究已经证实E2调控乳腺癌的多种恶性行为如迁移、转移等[6]。E2可以通过上调多个原癌基因如多配寡糖1(syndecan 1)[14]、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)[15]促进乳腺癌的进展。与之前研究一致，本研究以ER阳性的MCF-7乳腺癌和ER阴性的MDA-MB-231乳腺癌细胞为研究对象，发现E2能够显著促进MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移。乳腺癌患者死亡的主要原因可能与乳腺癌细胞的转移有关[16]，转移是几乎所有乳腺癌死亡的主要原因，乳腺癌的继发性生长主要发生在淋巴结，骨骼，肝脏，肺和大脑中，而肿瘤细胞转移涉及细胞脱落、迁移、侵袭、黏附及血管生成等多个生物学过程[17]；已有研究表明乳腺癌细胞EMT伴随迁移和侵袭活动增强[18]；FN表达上调和E-cadherin的减少或丢失被认为是EMT的重要标志, 临床研究也显示，EMT标志物E-cadherin和波形蛋白与乳腺癌淋巴转移存在明显相关性[19-20]。这些研究均提示，EMT是引起乳腺癌迁移、侵袭及转移的重要因素。进一步通过Western blot实验发现，E2可以显著诱导MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞FN蛋白表达上调和E-cadherin蛋白的表达下调。

大量研究已经证实，钙中性蛋白酶calpain在乳腺癌的增殖、迁移和侵袭过程中扮演着重要的角色。本课题组前期工作表明，雌二醇E2激活 MCF-7乳腺癌细胞中钙蛋白酶calpain，持续地诱导细胞周期蛋白E(cyclin E)的表达增加，进而调控乳腺癌细胞的恶性增殖[21]。钙蛋白酶包括多种亚型分子，广泛表达的钙蛋白酶分为μ-钙蛋白酶(Calpain1)和m-钙蛋白酶(Calpain2)，Calpeptin可抑制Calpain1和Calpain2[22]。同样，本课题组前期实验也发现，Calpeptin预处理可抑制E2诱导的MDA-MB-468乳腺癌细胞迁移[10]。为进一步探讨，钙蛋白酶Calpain是否调控E2介导的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞的EMT和迁移过程，我们应用钙蛋白酶抑制剂Calpeptin预处理细胞。与前期实验结果一致，本研究发现Calpeptin预处理可抑制E2介导的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移以及EMT过程。提示，E2可通过调控钙蛋白酶Calpain促进多种类型的乳腺细胞EMT和迁移。

综上所述，E2可能诱导ER阳性乳腺癌细胞MCF-7和ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 EMT和迁移，上述效应可能与Calpain的介导作用相关，提示钙蛋白酶Calpain是一个潜在的治疗靶点。