子痫前期患者胎盘组织中sFlt-1、PLGF及IGF-1的表达和临床意义*

文芳，黄秀桃，刘耀文，李健伟，雷后康，周金年

(贵州医科大学附属医院 妇产科，贵州 贵阳 550004)

子痫前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有疾病，一般在妊娠20周后患者可出现血压升高、蛋白尿、水肿，并伴头痛、眼花、胸闷、心慌、气促、恶心、呕吐和上腹不适等临床表现，严重影响了母婴健康，亦是导致孕产妇和围产儿死亡率升高的原因之一[1-2]。目前，临床对PE的病因及发病机制均尚未完全阐明，研究发现当胎盘从母体娩出后，PE所致的相关临床症状就减轻，甚至消失[3]，因此，胎盘异常在PE发病机制中的起着非常关键的作用。可溶性血管内皮生长因子受体-1(soluble vascular endothelial growth factor receptor 1，sFlt-1)认为是抗血管生成因子，在PE孕妇的血循环中显著升高，可拮抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)等各种促血管生成的作用，并造成广泛的血管内皮损伤，是导致患者出现高血压、蛋白尿及水肿的主要抗血管形成因子，同时参与了PE的发生发展[4-5]。目前的研究表明，sFlt-1可以作为PE的预测指标[6]。PLGF是在妊娠期起重要作用的蛋白，研究认为PLGF可以单独或与其他指标联合检查可用于预测早孕期PE的发生[7]。胰岛素样生长因子(insulin growth factor-1，IGF-1)是一种胎盘蛋白，在胚胎和胎盘的发育方面有重要作用，PE孕妇胎盘中IGF-1 较正常孕妇降低[8]。相关研究表明，在PE患者胎盘组织中PLGF和IGF-1的表达均低，并且随患者病情加重有下降的趋势，胎盘组织中两者的表达呈正相关[9]，但尚未见sFlt-1、PLGF及IGF-1同时用于PE孕妇的胎盘组织相关研究。故本研究通过分析PE孕妇胎盘组织中sFlt-1、PLGF及IGF-1的表达水平和临床意义，探讨与PE的关系，为临床早期诊断该疾病提供了依据。

1 对象与方法

1.1 对象、主要试剂和仪器

1.1.1对象 收集2017年7月1日—2018年8月31日本院产科住院分娩的重度PE孕妇25例作为重度PE组，轻度PE孕妇15例作为轻度PE组，PE的诊断标准参照文献[10]，要求此次妊娠为单胎、剖宫产分娩、且凝血功能正常。排除标准：妊娠合并糖尿病、肾脏病、心脏病、高血压等慢性疾病病史，既往有不明原因的习惯性流产、死胎、死产、胎儿畸形等不良孕产史，长期服用药物史及吸烟史等，本次怀孕合并急、慢性感染性疾病及证实胎儿有畸形。同时取正常晚期孕妇30例作为对照组。所有研究对象为自愿参加本研究，且签署知情同意书。

1.1.2主要试剂和仪器 一抗sFlt-1、PLGF及IGF-1抗体(美国Abcam公司)，PBS缓冲液(pH 7.3)、枸橼酸修复液(pH 6.0)、二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)、乙二胺四乙酸二钠盐(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)及显色试剂盒(北京中杉金桥公司)。

1.2 方法

1.2.1胎盘标本制作 所有孕妇剖宫产术中胎盘娩出后，肉眼检查胎盘，若胎盘表面无明显病理改变，避开胎盘母体面的出血区与钙化区，取约2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm全层胎盘组织，予0.9%氯化钠冲洗掉表面血液，10%的福尔马林固定24 h，经脱水、石蜡包埋，用于免疫组织化学检测。

1.2.2免疫组织化学检测及结果判断 采用免疫组织化学Envsion二步法检测胎盘组织中sFlt-1、PLGF及IGF-1的表达，其中阴性对照用PBS代替一抗。制备切片厚约4 μm，经苏木精-伊红染色法( hematoxylin-eosin staining，HE)染色判断切片的质量。免疫组化步骤如下：65 ℃恒温烤箱烤片1 h，二甲苯脱蜡30 min；梯度酒精水化至水，采用EDTA抗原修复液高温高压修复；分别加一抗sFlt-1、PLGF及IGF-1抗体(稀释比例分别为为1 ∶200、1 ∶180和1 ∶150)，置于湿盒中4 ℃冰箱过夜；次日，加二抗充分反应，DAB显色。复染细胞核用苏木素30 s，脱水于梯度酒精上进行；用二甲苯透明，中性树胶封片，染色方法按试剂盒说明进行。各组孕妇胎盘组织中sFlt-1、PLGF及IGF-1的免疫组织化学结果判定如下[11]，随机选取高倍视野5个，联合染色的强度和阳性细胞百分比进行计分，其中染色强度不着色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分及棕褐色为3分，阳性细胞百分比小于5%为0分、6%～25%为1分、26%～50%为2分、阳性细胞百分比>50%为3分，然后取2者得分乘积为最终分数，规定0分为阴性(-)，1～2分为“+”，3～4分为“++”，5～6分为“+++”。免疫组织化学结果由2名高年资病理医师采用双盲法独立检测，取平均值，“+”、“++”及“+++”视为阳性表达。

1.3 统计学分析

数据分析采用SPSS 21.0统计软件。计数资料采用率表示，分类资料采用χ2检验和Kruskal-Wallis检验进行分析，以P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 sFlt-1、PLGF及IGF-1表达

sFlt-1、PLGF及IGF-1在胎盘滋养层细胞中主要表达于细胞质，染色呈浅黄色、棕黄色或者棕褐色样颗粒染色(图1)。轻度及重度PE组孕妇胎盘组织sFlt-1阳性表达高于对照组，且随病情加重而增加(P<0.05)；轻度及重度PE孕妇胎盘组织中PLGF、IGF-1的阳性表达低于对照组，且轻度PE组孕妇阳性表达低于重度PE组(P<0.05，表1)。

图1 3组孕妇胎盘组织sFlt-1、PLGF及IGF-1的表达(Envision，×200)Fig.1 The expression of sFlt-1, PLGF, and IGF-1 in placental tissues of 3 groups of pregnant women(Envision，×200)

表1 各组孕妇胎盘组织sFlt-1、PLGF及IGF-1的阳性表达[n(%)]Tab.1 Comparison of the positive expression rate of sFlt-1, PLGF, and IGF-1 in placental tissues of 3 groups of pregnant women[n(%)]

2.2 sFlt-1、PLGF和IGF-1表达

轻度及重度PE组孕妇胎盘组织sFlt-1表达强度等级均高于对照组(P<0.05)，但轻度与重度PE组孕妇比较差异无统计学意义(P>0.05)；轻度及重度PE组孕妇胎盘组织PLGF和IGF-1的表达强度等级均低于对照组(P<0.05)，且轻度组两项指标的表达强度低于重度组孕妇(P<0.05，表2)。

表2 各组孕妇胎盘中sFlt-1、PLGF和IGF-1表达[n(%)]Tab.2 Comparison of the intensity of sFlt-1, PLGF and IGF-1 in placental tissues of 3 groups of pregnant women[n(%)]

3 讨论

由于PE可能会导致母儿的不良妊娠结局，故近年来PE成为妊娠期高血压疾病的研究重点[12]，相关研究认为PE的病因起源于胎盘，因早期各种因素引起胎盘缺血缺氧，胎盘缺血时分泌各类胎盘因子，广泛作用于母体血管内皮细胞，使母体肝脏、肾脏等全身多器官功能损伤，出现不良妊娠结局[13-14]。sFlt-1具有酪氨酸激酶活性，能与内皮细胞表面受体VEGFR-1和VEGFR-2结合形成异源二聚体，可以通过抑制VEGF和PLGF的生物学活性，致血管生成障碍和血管内皮细胞损伤，从而抑制了血管生成[15]。大量研究表明sFlt-1可直接参与血管形成和胎盘绒毛浸润[16-18]。有研究发现产后48 h内sFlt-1水平明显下降，提示过量的sFlt-1可能来源于胎盘[19]。本研究检测胎盘中sFlt-1的表达情况，结果显示，PE组孕妇胎盘组织sFlt-1阳性表达率比正常妊娠组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，跟既往相关报道一致，说明sFlt-1在PE患者胎盘中的高表达在PE的发病过程中起着重要的作用。但是本研究中轻度PE组与重度PE组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，与既往研究报道不一致[20-21]。分析导致这一结果的原因，考虑为本次研究样本量较小。根据文献报道，sFlt-1参与PE的可能机制是sFlt-1损伤血管内皮细胞后子宫内膜细胞及其它血管收缩，胎盘组织缺血缺氧，大量的活性细胞因子得到合成和释放，最终发生妊娠期高血压疾病，从而加重PE患者的病情[22]。

PLGF对滋养层细胞和VEGF功能具有调节作用[23]。PLGF与酪氨酸酶受体结合后，可促进早孕时滋养细胞的增殖，增加血管通透性，促进新生血管生成[24]。本研究显示病例组胎盘组织中PLGF表达显著低于对照组，提示PLGF在PE患者胎盘组织中表达量很低。推测导致这一结果的原因可能为sFlt-1与PLGF结合后刺激血管生成，从而出现了PE的相关临床表现。

IGF-1可促使血管内皮细胞释放凝酶原激活物，从而改善胎盘功能[25]，刺激滋养细胞侵入、迁移以及舒张血管，参与血压调节[26]。相对正常孕妇而言，PE孕妇胎盘中IGF-1的表达降低，这些改变与PE这种疾病密切相关[27]。本研究结果显示PE组孕妇胎盘组织中IGF-1表达较对照组明显下降，重度PE组较轻度PE组孕妇胎盘组织中IGF-1表达下降(P<0.05)，说明IGF-1与PE病情的严重程度有关。推测PE患者IGF-1在胎盘组织中表达下降的可能机制为PE时患者全身小动脉痉挛、胎盘缺血缺氧、供血不足，出现胎盘功能障碍，使得胎盘分泌的生长激素减少，因为妊娠期间IGF-1受血液循环中胎盘生长激素的调节，所以IGF-1的合成与分泌，导致IGF-1表达降低。

综上所述，胎盘组织中sFlt-1、PlGF及IGF-1的表达与PE发生发展过程有直接关系，研究sFlt-1、PlGF、IGF-1在PE发病中的作用，可为早期诊断和治疗PE提供思路。