PI3K信号通路的关键信号分子AKT和mTOR在胶质瘤中的表达及意义*

吴国敏, 史珂蔓, 刘娟, 冯玲, 杨宇石, 李珀, 徐澍**

(1.贵州医科大学 口腔医学院 口腔组织病理学教研室，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 临床医学院 病理学教研室，贵州 贵阳 550004)

胶质瘤是源自神经上皮的最常见的原发性颅内肿瘤，由于其在空间的“占位”效应及对局部脑组织功能的影响，手术切除常作为治疗胶质瘤的首选方法，然而因为肿瘤呈浸润性生长，且与正常脑组织无明显分界，手术切除常不能完全做到病理切除，因此，患者容易出现复发或向高级别转化。目前，胶质瘤仍高居颅内肿瘤死亡率第一位，随着科学技术的发展，治疗脑内胶质瘤的手段除了手术切除以外还加入了术后辅助放疗和(或)化疗，在化疗药物方面，替莫唑胺是目前治疗胶质瘤惟一有明确疗效的[1]，因此，迫切需要在胶质瘤中发现新的功能靶点，以研制出更有效的药物。近年来，磷脂酰肌醇3′-激酶信号通路(the phosphatidylinositol 3′-kinase signaling pathway，PI3K)已逐渐成为了研究肿瘤发病机制的热点[2-3]，但该通路与人脑胶质瘤发生、发展的关系尚少见报道。因此，本研究拟采用免疫组织化学方法检测PI3K信号通路的关键蛋白激酶B(AKT)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在人脑胶质瘤组织中的表达，同时观察这些指标在不同性别、年龄、肿瘤发生部位及分级患者的表达水平，以期为研究胶质瘤的发生机制提供基础理论依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集2009年1—12月脑外科收治的患者临床资料，随机选取45例患者的存档蜡块及25例其它非肿瘤病变的脑血管疾病患者的脑组织蜡块，所有患者均为首次诊断，有完整的临床资料，包括性别、年龄、家族史、肿瘤部位等。由2位有10年以上工作经历的副主任医师采取双盲法按照第4版《WHO中枢神经系统肿瘤分类》[4]对样本分类和分级进行确诊。实验组纳入胶质瘤患者45例，男性23例、女性22例，<40岁29例、≥40岁16例，肿瘤发生于脑叶者34例、深部者11例，病理分级低级别(Ⅰ～Ⅱ级)30例、高级别(Ⅲ～Ⅳ级)15例；另取25例脑血管病患者的正常脑组织存档蜡块作为对照组，男性19例、女性6例，<40岁14例、≥40岁11例。实验组与对照组患者性别及年龄分布差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1主要试剂 免疫组化超敏反应试剂盒、载玻片、乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt antigen retrieval solution，EDTA)、二氨基联苯胺显色试剂盒(3,3-N-Diaminobenzidine tertrahydrochloride，DAB)及磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)均购于中国山东迈新生物技术有限公司。

1.2.2主要仪器 高清显微镜(AxioLab.A1 Carl Zeiss)、轮转式切片机(HM325 Thermo)、全自动染色机(GeminiAS Thermo)、自动封片机(ClearVue Thermo)、病理组织漂烘仪(RHY-Ⅲ 中威)、超纯水机(ZYTEST-Ⅰ-40L卓越)、电热鼓风恒温干燥箱(101-1AB 泰斯特)。

1.2.3抗体 免抗人AKT(A444)单克隆抗体(稀释浓度1 ∶150)、免抗人mTOR(S2442) 单克隆抗体(稀释浓度1 ∶200)及免疫组化二抗均购于中国南京沃尔森生物技术有限公司。

1.3 方法

采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法(SP)法，按试剂盒说明书操作，所有抗体试剂均现配现用。判读标准：根据《免疫组织化学反应结果的判断标准》[5]，随机选取10个高倍镜(×400)视野，计数其中1 000个胶质瘤细胞，按着色强度计分，无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分及棕褐色为3分；计数随机视野内细胞核或(和)细胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒的细胞所占的比例，阴性为0分，≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分及≥75%为4分；将着色强度和阳性细胞数得分乘积>3分判定为阳性表达，≤3分判定为阴性表达；切片经两位副高以上病理诊断医师双盲法复查判读，判读达成一致后进行数据分析处理。

1.4 统计学处理

实验数据采用EXCEL、SPSS 25.0统计软件进行分析，计数资料采用频数(n)、率(%)表示，数据比较采用χ2检验，2种蛋白表达的相关性应用Pearson相关系数进行分析，均以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AKT及mTOR的表达

实验组及对照组中的阳性表达见图1A，AKT阳性着色定位主要在细胞核及细胞质，而mTOR阳性着色定位主要在细胞核。AKT及mTOR在实验组及对照组中的阳性表达情况见图1B。分析统计2种蛋白的表达结果发现，AKT表达在实验组(29例/45例，64.4%)高于对照组(5例/45例，20%)，mTOR表达在实验组(32例/45例，71.1%)高于对照组(7例/45例，28%)，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：A为SP法检测各蛋白结果(箭头表示阳性表达细胞)，B为各蛋白阳性表达率的条图；(1)与对照组比较，P<0.05。图1 两组胶质瘤患者脑组织中的AKT和mTOR蛋白表达(SP，×400) Fig.1 AKT and mTOR protein expression in brain tissue of glioma patients between the two groups (SP，×400)

2.2AKT及mTOR表达的相关性

统计分析AKT及mTOR表达的相关性时发现，实验组AKT和mTOR的表达存在显著正相关关系(r=0.448，P<0.01)；而对照组AKT和mTOR的表达无相关关系(r=-0.089，P>0.05)。见表1。

表1 两组胶质瘤患者脑组织细胞AKT和mTOR蛋白表达的相关性Tab.1 Relationship between AKT and mTOR protein expression in brain tissue of glioma patients between the two groups

2.3 实验组AKT及mTOR蛋白表达与临床病理参数的关系

实验组患者的脑组织在不同性别、年龄、肿瘤发生部位、病理分级之间，AKT及mTOR的阳性表达差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 实验组AKT和mTOR蛋白的阳性表达与临床病理参数的关系[n(%)]Tab.2 Relationship between positive expression of AKT and mTOR protein and clinicopathological parameters in experimental group[n(%)]

3 讨论

胶质瘤因其发生部位导致临床上很难做到完全根治，即使是经过标准化疗程治疗后的一些患者，出现复发的机率并没有明显降低，以往的文献中多将此归咎于肿瘤异质性方面。不论是胶质瘤还是其他肿瘤，复发往往会导致患者生存期的陡然降低。随着EGFR受体拮抗剂投入临床使用，为胶质瘤靶向治疗提供可能。但是在肺癌等实体肿瘤中EGFR受体拮抗剂使用常在短期内出现耐药性[6-7]。因此，寻找新的肿瘤靶向治疗药物已成为目前肿瘤研究的热点。近些年来，在肿瘤的研究中，越来越多的PI3K信号通路的关键信号分子被发现与肿瘤恶性生物学行为息息相关[2-3]。PI3K信号通路即磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导通路，又称PI3K/AKT/mTOR信号通路，主要参与细胞的生命活动，包括细胞增殖、活化、凋亡及调节这些功能的作用，是细胞组织生命及生长的调控中枢及网络系统[8]。简单来说，PI3K信号通路的活化是由PI3K激活开始，PI3K活化后的结果是在质膜上产生第二信使PIP3，PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT和PDK1结合, 促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser-308位点，活化的AKT通过磷酸化mTOR 的Ser-448位点激活mTOR，被激活后的mTOR将大大提高RNA的翻译效率，从而具有调节细胞生长的功能，此机制在肿瘤的发生发展过程中起着及其重要的作用[9]。

本研究发现，实验组AKT及mTOR的阳性表达率均明显高于对照组，这与王卫峰、张浩等[10-11]研究结果相似，他们在食管癌组织中发现AKT明显高于对照组，与徐余超[12]的研究结果相似，他们在研究胃癌时发现，低分化胃癌组AKT及mTOR阳性表达显著高于正常组。本组研究结果表明AKT及mTOR广泛存在于胶质瘤中，很可能是导致胶质瘤发生发展的重要因素。在分析AKT及mTOR之间的相关性时发现，实验组AKT和mTOR之间存在显著正相关关系，而对照组无明显相关关系，说明当PI3K活化后，通过激活AKT进一步促进PI3K信号通路活化，AKT活化后又进一步激活了mTOR，mTOR活化后促进了肿瘤细胞增殖的机制广泛存在于胶质瘤组织中。这与杨满等[13]研究相似。进一步分析AKT及mTOR与临床病理参数的关系时发现，AKT及mTOR表达在不同患者性别、年龄、肿瘤发生部位及病理分级中无显著差异(P>0.05)，这与董君等[14]研究结果相似，与刘东刚等[15]研究部分相似，他们在研究p-AKT、p-mTOR在胃癌组织中的表达时发现与分化程度、TNM分期有关，与年龄、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移情况无显著相关。

综上，本研究结果发现PI3K信号通路中的关键蛋白AKT及mTOR在胶质瘤中存在过表达现象，由此推测PI3K信号通路的激活参与了胶质瘤的发生发展，检测AKT及mTOR具有一定的临床应用价值。但AKT及mTOR阳性表达与胶质瘤患者的临床病理特征(性别、年龄、肿瘤发生部位及病理分级)无显著相关，总结文献分析，猜测可能存在其他因素与之相关，如复发、转移等，将在接下来的实验中进一步验证，本实验为研究胶质瘤的发病机制和进展机制提供了一定的实验依据。