竹红菌素-聚(甲基丙烯酸甲酯-co-甲基丙烯酸) 纳米纤维的制备及其光敏抗菌性能

2021-01-05王婷婷曹秀明王清清

纺织学报 2020年5期

王婷婷，刘梁，曹秀明，王清清，

(1. 生态纺织教育部重点实验室(江南大学)，江苏无锡 214122； 2. 江苏阳光股份有限公司，江苏无锡 214400)

抗生素在全球范围内的滥用，使金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌对抗生素表现出越来越强的耐药性[1-2]，因此，近年来关于新型抗菌方法的研究受到广泛关注。光动力抗菌化学疗法(PACT)[3]具有广谱抗菌性，且不会导致细菌产生抗药性的特点，其原理是在可见光照射下，光敏剂在有氧条件下产生具有细胞毒性的活性氧物质来使微生物失活。相较于传统抗菌方法，该疗法所使用的光敏剂毒副作用低，在有效杀灭微生物的同时，不会使其产生抗性，且抗菌(包括细菌、真菌及病毒在内的多种微生物)范围广，具有良好的研究前景[4]。常见的光敏剂有卟啉类光敏剂、阳离子型光敏剂、酞菁类光敏剂、玫瑰红等[5]。

竹红菌素(Hc)是从竹红菌中提取的天然光敏剂，其组分主要有2种，竹红菌甲素和竹红菌乙素[6-7]。竹红菌素具有原料易得，提纯过程简单，三重态和单重态氧量子产率高，光毒性高而暗毒性低，体内清除速度快等优点[8],是一种前景较好的天然光敏剂，市售的云南白药集团生产的竹红菌素软膏目前已用于治疗多种皮肤病。光敏剂在固体材料上的固定为其使用提供了便利，目前，关于光敏剂竹红菌素的固定化已有大量研究，如固定在脂质体[9-10]、纳米颗粒[11-13]等材料上，但对其在静电纺纳米纤维材料上的固定化及其抗菌性能评价方面的研究并不多。

静电纺纳米纤维具有比表面积髙、纤维直径细，吸附性好等优异性能，其所用原料来源广泛，具有良好的可加工性，且在一定程度上对抗菌效率有提高作用[14-15]，故竹红菌素在静电纺丝膜上的负载具有较好的研究意义。本文采用静电纺丝法制备含竹红菌素的聚(甲基丙烯酸甲酯-co-甲基丙烯酸)(P(MMA-co-MAA))纳米纤维膜(Hc-PM)，并对纳米纤维的形态、表面微观结构、热稳定性、单线态氧的产生以及底物氧化性能进行研究，最后评价了该材料对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的光敏抗菌效果。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

材料：聚(甲基丙烯酸甲酯-co-甲基丙烯酸)[16]，实验室自制；竹红菌素，江南大学生物工程学院；三氯甲烷(CHCl3，分析纯)、二甲基甲酰胺(DMF，色谱纯)、碘化钾(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮(TEMP)、重水(D2O)，上海维塔化学试剂有限公司；金黄色葡萄球菌(ATCC-6538)及大肠杆菌(8099)，上海协久生物科技有限公司。

仪器：静电纺丝装置，实验室自制；UH4150型紫外-可见-近红外分光光度计、SU1510型扫描电子显微镜(SEM)，日本日立株式会社；UV-2600型紫外-可见分光光度计，日本岛津制作所；DCAT-21型表-界面张力仪，德国Dataphysics公司；NICOLET IS10型傅里叶变换红外光谱仪，中国赛默飞世尔科技有限公司；Q500型热重分析仪，美国TA公司；XQ500 W型可调型氙灯电源，上海蓝晨电子有限公司；EMX plus-10/12型电子顺磁共振波谱仪，德国布鲁克科技有限公司；BSP-150型生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 纺丝溶液的制备

纺丝液溶质P(MMA-co-MAA)质量分数为6%，质量为2 g，溶剂DMF与CHCl3的质量比为3∶7，二者混合后分别添加质量分数为0.0%、0.1%、0.3%、0.5%的光敏剂竹红菌素，避光置于磁力搅拌器上常温搅拌10 h至完全溶解得到纺丝液。

1.3 纳米纤维膜的制备

将纺丝液倒入表面覆有锡纸的规格为20 mL的注射器中，并安装在注射泵上，在针头上加上正电势使纺丝液表面带正电荷。在高压静电场作用下通过静电纺丝机进行纺丝，纺丝液所受电场力克服溶液表面张力后，喷射出带电射流，随着溶剂的挥发，固化为纤维随机排布于收集装置上[17]。静电纺丝工艺条件为：室温，避光，纺丝电压19 kV，注射泵控制溶液流速1 mL/h，纺丝接收距离15 cm，用覆有锡纸的滚筒作为接收装置。通过实验分别纺得不含竹红菌素的PM膜及不同质量分数Hc-PM纳米纤维膜。

1.4 测试与表征

1.4.1 形貌观察及亲疏水性测试

将制得的纳米纤维膜真空干燥后粘贴在样品台上，为降低其表面放电效应，进行喷金处理。用扫描电子显微镜(SEM)观察纤维的表面形貌和结构，扫描电压为5 kV。

利用Acrobat测量软件，取SEM照片中相同面积范围内100段纤维进行测量，计算其平均直径及标准差。

采用表-界面张力仪测试材料的静态接触角，对材料亲疏水性进行表征，进一步分析其表面结构。

1.4.2 纳米纤维膜的化学结构测试

利用紫外-可见-近红外分光光度计对纳米纤维膜进行扫描；配制浓度为0.1 mmol/L的竹红菌素溶液，利用紫外-可见分光分度计对其进行扫描得到光谱图，扫描波段均为350～700 nm。

采用傅里叶变换红外光谱仪中衰减全反射红外光谱法(ATR-FT-IR)测试分析纳米纤维膜的化学结构。测试分辨率为4 cm-1，扫描次数为16，波数范围为4 000～525 cm-1。

1.4.3 纳米纤维膜的热力学性能测试

采用热失重分析仪(TG)对纳米纤维膜的热力学性能进行测试分析。将样品(约6 mg)置于氧化铝坩埚内，进行程序升温：初始温度为30.0 ℃，升温速率为10.0 ℃/min，最终温度为800.0 ℃，载气为氮气，其流速为40.0 mL/min。

1.4.4 单线态氧的电子顺磁共振信号测试

利用电子顺磁共振波谱仪探测纳米纤维膜经光照后是否有单线态氧生成。将Hc-PM纳米纤维膜置于温度为60 ℃的干燥箱中，烘燥3 h，剪成2 cm×2 cm规格，随后将其分别加入含有14 μmol TEMP的3 mL氧饱和D2O溶液中，在可见光(光强为65 mW/cm2，波长为420～780 nm)条件下照射1 h；然后将所得溶液转移到石英毛细管中，固定在波谱仪的谐振腔中测试得到样品的电子顺磁共振(EPR)信号波谱。测试条件为：在0.335 T的中心场和0.007 T的扫频宽度的磁场下操作，微波频率9.17 GHz，功率10 mW，信号通道的扫描时间0.128 s。

1.4.5 纳米纤维膜的氧化性能

通过底物KI溶液在光照条件下的吸光度变化来判断样品的氧化能力。将PM及Hc-PM纳米纤维膜置于温度为60 ℃的干燥箱中，烘燥3 h，并剪成1 cm×1 cm规格，分别置于20 mL浓度为0.1 mol/L的 KI溶液中，在可见光(光强为65 mW/cm2，波长为420～780 nm)照射下，每隔5 min用紫外可见分光光度计测量1次溶液吸光度。

1.4.6 光动力抗菌性能评价

参考AATCC 100—2012《抗菌纺织品的评价方法》对Hc-PM纳米纤维膜进行抗菌性能评价。

将干燥的PM以及Hc-PM纤维膜分别裁为若干个形状、厚度均一的圆形试样，置于24孔板内。取0.1 mL浓度为1～3×108CFU/mL的菌液(PBS缓冲液)接种于各样品上，将各组样品分别置于光照(光强为65 mW/cm2，波长为420～780 nm)及暗室条件中培养30 min后，取0.9 mL的PBS缓冲液于24孔板中，振荡摇匀后，取0.1 mL原菌液及试样上的菌液，加入0.9 mL PBS缓冲液，依次等梯度稀释1×106倍。分别从各稀释梯度的溶液中取10 μL滴在培养基平板上，置于恒温培养箱(37 ℃)中培养24 h。最后记录其菌落数计算抑菌率S。

式中：N0为原菌液可计数列的菌落最大值；Ni为试样抗菌后与原菌液对应梯度下的菌落值。

2 结果与讨论

2.1 形貌及亲疏水性分析

竹红菌素质量分数分别为0.0%、0.1%、0.3%、0.5%的纳米纤维膜的扫描电镜照片如图1所示，通过Acrobat软件测量纳米纤维的直径如表1所示。

图1 不同Hc质量分数的纳米纤维膜的 SEM照片(×5 000)Fig.1 SEM images of nanofibrous membranes with different Hc concentrations(×5 000)

表1 PM和Hc-PM纳米纤维膜的直径分布Tab.1 Diameters of PM and Hc-PM nanofibrous membrances

由图1和表1可知，PM膜中纳米纤维直径粗细均匀，表面光洁，随机取向分布形成精细的三维网状结构；添加竹红菌素后，Hc-PM膜中纳米纤维粗细不匀程度增加，纤维表面有粗节，这是因为竹红菌素为脂溶性有机分子，在含极性溶剂DMF的纺丝液中易自发聚集[18]。随着竹红菌素质量分数的增加，Hc-PM纳米纤维的平均直径越来越粗，纤维间略有黏连，这是由于脂溶性竹红菌素添加后纺丝液的浓度、黏度增加，电导率下降，纺丝液在静电场中所受到的牵伸力降低的缘故[19]。相较之下，Hc-PM中纳米纤维的横截面比PM中纳米纤维不规则，且直径不匀度也较高。

材料本身的性质，表面形态及直径分布对其亲疏水性会产生一定影响。经静态水接触角测试可知，PM及Hc质量分数为0.5%的Hc-PM纳米纤维膜的接触角分别为109.2°和131.4°，均表现为疏水性。由于竹红菌素具有疏水性，故添加了竹红菌素的Hc-PM膜的疏水性更佳[20]。另外，对于疏水性材料，表面较大的粗糙度有利于其截留更多的空气，从而增大接触角[21]。总体来说，Hc-PM纳米纤维更不规则，直径不匀度更高，表面粗糙度更大，故Hc-PM膜接触角更大，疏水性更好。

2.2 化学结构分析

通过紫外光谱及红外光谱探究竹红菌素于纤维膜上的负载方式，结果分别如图2、3所示。图中Hc-PM纳米纤维膜的Hc质量分数为0.5%。

图2 竹红菌素溶液和纳米纤维膜的紫外光谱图Fig.2 UV-vis spectra of Hc solution and nanofibrous membranes

图3 PM和Hc-PM纳米纤维膜的红外光谱图Fig.3 FT-IR of PM and Hc-PM nanofibrous membranes

天然光敏剂竹红菌素主要有2种组分：竹红菌甲素和竹红菌乙素，其中95%以上为竹红菌甲素，本文实验所用竹红菌素为混合物。由图2可知，PM膜在350～700 nm波段无特征峰，Hc溶液有3个竹红菌素的典型特征峰，分别为468.5、528.0和571.0 nm；同样地，Hc-PM也有3个特征峰，分别为465.0、530.0和571.0 nm，与Hc溶液相符。这说明Hc-PM膜中负载有竹红菌素，且其化学组分没有因静电纺丝过程而改变。

2.3 热力学性能分析

通过热重分析研究PM及Hc质量分数为0.5%的Hc-PM纳米纤维膜的热学性能，结果如图4所示。可知：在350 ℃前，纳米纤维膜有较小的质量损失，主要是由于聚合物中含有的水分和小分子物质等杂质的去除，以及纤维膜侧链基团的初步降解；在300～450 ℃范围内，纳米纤维膜骨架开始降解[7]，使其质量明显下降，在450 ℃达到完全降解。比较2条曲线可知，竹红菌素的加入使纳米纤维膜骨架降解的初始降解温度由302 ℃降至292 ℃，最大降解速率温度由426 ℃降至412 ℃，降解速度稍稍变快，说明竹红菌素的加入使得纤维膜的热稳定性下降，但影响较小。

图4 PM和Hc-PM膜的热稳定性曲线Fig.4 TG(a)and DTG(b)curves of PM and Hc-PM nanofibrous membranes

2.4 单线态氧的电子顺磁共振信号分析

光敏剂竹红菌素经光照后跃迁至激发态，将分子氧转化为具有高反应活性、高氧化性的单线态氧(1O2)。由于1O2的寿命较短，因此，可用捕获剂2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮(TEMP)捕获1O2生成2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮-N-氧化物自由基(TEMPO)，通过检测TEMPO的电子顺磁共振(EPR)信号来判断是否有1O2生成[22]。Hc质量分数为0.5%的Hc-PM膜经光照后产生的EPR信号如图5所示。

图5 光照Hc-PM膜与TEMP生成的TEMPO的EPR信号Fig.5 EPR signal of TEMPO generated by Hc-PM membrane and TEMP after illumination

由图5可知，纯D2O空白样无信号，而Hc-PM膜呈现出典型的氮氧自由基的三重峰，证明了1O2的存在。说明竹红菌素的负载使得Hc-PM膜经光照后能将O2转化为1O2，发挥其光敏效能。

2.5 氧化性能分析

竹红菌素经光照后产生1O2，利用1O2对I-的氧化作用进行氧化性能分析[23]。图6示出Hc质量分数为0.5%的Hc-PM纳米纤维膜在持续光照条件下，溶液紫外吸收变化的光谱图。可知，在1O2的氧化作用下，I-被氧化为I3-，且I3-的浓度正比于1O2的浓度[24]。随着I3-的浓度上升，溶液呈淡黄色，在紫外光谱的287和351 nm处出现其特征峰，后文选取351 nm作为测定波长。

图6 Hc-PM纳米纤维膜的KI溶液紫外吸收光谱Fig.6 UV-Vis absorption spectra of KI solution photooxidized by Hc-PM nanofibrous membrane

图7为PM和Hc质量分数为0.5%的Hc-PM膜随光照时长的增加，在351 nm处吸光度的变化图。可知：PM膜经可见光照射后，吸收值有较小上升趋势，说明PM膜和KI在空气中能发生少量的氧化反应；而添加了竹红菌素的Hc-PM膜经光照后，351 nm处吸收值显著增加，说明其具有良好的光动力氧化性能。

图7 PM和Hc-PM膜在351 nm处的KI溶液紫外吸收图Fig.7 UV-Vis absorbance of KI solution at 351 nm photooxidized by PM and Hc-PM nanofibrous membranes

为进一步证明竹红菌素的添加赋予了PM膜氧化能力，检测竹红菌素质量分数为0.1%和0.3%的Hc-PM膜底物的氧化能力，结果如图8所示。可知，随着竹红菌素质量分数的增加，Hc-PM纳米纤维膜的氧化能力有所提高。

2.6 光动力抗菌性能分析

表2示出PM和竹红菌素质量分数为0.5%的Hc-PM膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率测试结果。可知，PM膜无论是在光照条件，还是暗室条件下，对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均无明显抗菌效果。Hc-PM膜在光照条件下，对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌效果，抑菌率约为99.97%；但对大肠杆菌的抗菌效果不佳，抑菌率约为54.41%。主要原因有2个：一是竹红菌素本身对革兰氏阴性菌不敏感[6]；二是革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的结构不同，属于革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌外膜成分主要为肽聚糖，其疏松多孔的结构易被光敏剂分子及活性氧物质穿透，而属于革兰氏阴性菌的大肠杆菌的外膜在肽聚糖的基础上，还有脂多糖、脂质双层和脂蛋白，结构较为密实，因而能有效阻止一部分光敏剂分子及活性氧物质穿透其结构并对其产生光敏抗菌效果[25]，因此，Hc-PM膜对大肠杆菌的抗菌效果不如金黄色葡萄球菌。