聚羟基脂肪酸酯/海藻酸钠纳米纤维的制备及其性能

孙范忱， 郭 静,2， 于 跃,2， 张 森,2

(1. 大连工业大学 纺织与材料工程学院， 辽宁 大连 116034； 2. 辽宁省功能纤维及复合材料工程技术中心， 辽宁 大连 116034)

人体创伤发生的频率逐年增加[1-2]，其中外周神经损伤约占5%，神经修复成为急需解决的重要问题[3-4]。常用的神经修复方法是自体移植，其受到来源、供区缺损和供需不匹配等限制，因此，人造神经导管材料应运而生[5-6]。

聚羟基脂肪酸酯(P(3HB-co-4HB))是通过微生物发酵获得的可降解材料，其生物相容性、可塑性、韧性等性能较为突出，所以在农业、包装、生物学及组织工程领域应用广泛[7-8]，但由于P(3HB-co-4HB)表面缺乏活性功能基团，使细胞膜与其接触时产生特异性相互作用，导致细胞在材料表面粘附、迁移、增殖受到一定限制。为解决这一问题，刘琴等[9]通过制备同轴P(3HB-co-4HB)/聚乙烯醇复合支架来改善其生物相容性；Wang等[10]通过调解共混物中聚乳酸(PLA)的含量制得了具有高孔隙率、高吸水性的P(3HB-co-4HB)/PLA材料，并用于软骨组织培养。

海藻酸钠是从海中提取的一种天然多糖类化合物，是β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)按(1→4)链连接而成。其生物相容性好，亲水性优良，有利于细胞的粘附、增殖和分化[11-12]，但单一SA刚性大，耐水性差，很难静电纺丝成形[13-14]。将P(3HB-co-4HB)和SA共混可在性能上实现取长补短。然而P(3HB-co-4HB)为亲油性，SA为亲水性，在常规情况下很难共溶解，为此，本文以月桂基葡糖苷(APG)为乳化剂，成功将P(3HB-co-4HB)与SA复合，制备了P(3HB-co-4HB)/SA纳米纤维，并对纳米纤维的表面形貌、孔隙率、毒性、生物相容性等进行表征。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

原料与试剂：海藻酸钠(SA)，相对分子质量为15 000，其中G片段与M片段比例为1.2∶1，青岛海之林生物有限公司； P(3HB-co-4HB)，数均分子量约为7×105，其中4HB的质量分数为15%，山东意可曼科技有限公司；三氯甲烷，分析纯，西陇化工股份有限公司； 烷基糖苷(APG)，山东优索化工科技有限公司；RSC96血旺细胞，广州吉妮欧生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK8)，合肥新恩源生物技术有限公司；乙醇(75%)，铁岭康泰消毒剂有限公司；戊二醛，分析纯，北京索莱宝科技有限公司；叔丁醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；磷酸缓冲盐溶液(PBS)，北京索莱宝科技有限公司。

仪器：Spectrum-One B型红外光谱仪,美国PE公司；DSC200F3型差示扫描量热仪,德国耐驰仪器制造有限公司；JSM-7800F型扫描电子显微镜(SEM),日本电子(JEOL)；TL-Pro-BM型高压静电纺丝机,深圳市通力微纳科技有限公司；VD-850型桌上式洁净工作台,苏州净化设备有限公司；酶标仪，上海沛欧分析仪器有限公司。

1.2 实验过程

本文实验机制和实验过程如图1所示。首先将SA溶于去离子水中配制不同质量分数(0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%)的SA水溶液。然后将含有一定比例的APG和三氯甲烷加入到SA水溶液中，使APG起到乳化作用，降低共混溶液的表面张力，随后将共混溶液放置在超声波细胞粉碎机上以400 W的功率均质15 min，然后加入一定质量的P(3HB-co-4HB)，放置于恒温摇床里连续振荡12 h，待P(3HB-co-4HB)完全溶解后，再次放在超声波细胞粉碎机上以400 W的功率均质15 min，使SA稳定分布于P(3HB-co-4HB)溶液中得到纺丝溶液。最后通过静电纺丝机进行静电纺丝，得到P(3HB-co-4HB)/SA纳米纤维膜。纺丝条件：环境温度为(35±1)℃，相对湿度为(20±5)%，静电压为20 kV，喷丝口距接收板距离为20 cm，流速为2.0 mL/h。

图1 实验机制和实验过程Fig.1 Experimental process and analysis of co-dissolution mechanism

1.3 纳米纤维膜化学结构测试

采用红外光谱仪测试P(3HB-co-4HB)/SA纳米纤维膜的化学结构。将纳米纤维粉末状样品用KBr压片，扫描波数范围为4 000～400 cm-1。

1.4 纳米纤维膜热性能测试

采用差示扫描量热仪测试样品的热性能，测试温度范围为-40～40 ℃，升温速率为10 ℃/min，氮气气氛。

1.5 纳米纤维膜表面形貌观察

首先对纤维膜进行喷金处理，然后采用扫描电子显微镜观察样品的表面形貌。加速电压为10 kV，放大倍数为200～2 000倍。

1.6 纳米纤维膜孔隙率测定

将3 cm×3 cm尺寸的纤维膜浸润于去离子水中20 min，取出用滤纸吸去膜表面水分，称取质量记为m1；然后将膜置于真空烘箱烘干至质量恒定，称取质量，记为m2。用下式计算孔隙率：

式中：A为纤维膜表面积，cm2；Ld为膜厚，cm；ρ为去离子水的密度，取1 g/cm3。

1.7 纳米纤维膜的细胞毒性测试

采用浸提液法对生物医用材料进行毒性实验。将稀释好的RSC 96血旺细胞种植在96 孔细胞培养板中，置于37 ℃、5%的CO2的培养箱中培养24 h后，吸出旧的培养液，换入新的培养液，然后分别加入纳米纤维膜的浸提液，不加纤维膜的为空白组，在相同条件下分别培养12～96 h。取出细胞培养板，在各孔中加110 uL的CCK8 培养基混合液，在细胞培养箱中放置30 min 后用酶标仪在450 nm 下测定各孔的吸光度，取平均值并通过与对照组比较来判断细胞的毒性，计算方法 ：细胞的相对增殖率P=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。细胞毒性划分标准：细胞相对增殖度大于等于100%为0级，75%～99%为1级，50%～74%为2级，25%～49%为3级，1%～24%为4 级，0为5 级。

1.8 体外细胞培养

为观察细胞在材料上的粘附能力及形态，所有材料用75%乙醇浸泡5 min进行消毒，然后用无菌PBS清洗，每次5 min，重复3次；随后将材料放入细胞培养板，每孔大约接种2×103个/mL的RSC96血旺细胞，放入细胞培养箱培养72 h作为扫描电镜观察的标本，待培养时间到达后，先吸出旧培养液，然后用PBS洗3次，再用4%戊二醛固定4 h，随后进行乙醇梯度脱水各10 min、50%叔丁醇和纯叔丁醇各处理10 min，最后用冻干机冷冻干燥，喷金后用扫描电镜观察其表面形貌。

2 结果与讨论

2.1 化学结构分析

图2 为SA、P(3HB-co-4HB)和P(3HB-co-4HB)/SA(SA质量分数为6%)纤维膜的红外光谱图。可以看出：SA在1 624和1 416 cm-1处存在明显的吸收特征峰，为SA大分子六元环上COO-的不对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰，在3 435 cm-1处为O—H伸缩振动峰[14]；P(3HB-co-4HB)的酯基峰在1 726 cm-1处，羰基峰在1 340和1 186 cm-1处；P(3HB-co-4HB)/SA纤维膜的特征峰基本上是SA和P(3HB-co-4HB)吸收峰的加和，没有明显新峰出现，说明二者以共混为主，但观察可发现纤维膜在3 435 cm-1处的羟基的吸收峰强度变大，峰变窄，这是由于SA中存在大量羟基、羧酸基，P(3HB-co-4HB)存在大量的酯基，APG也存在大量的羟基和醚基，三者之间易形成如图3所示的氢键作用，正是这种氢键作用保证了溶液的均匀稳定。

图2 SA、P(3HB-co-4HB) 和P(3HB-co-4HB)/SA的 红外光谱图Fig.2 Infrared spectrum of SA，P(3HB-co-4HB) and P(3HB-co-4HB)/SA composites

图3 氢键结构示意图Fig.3 Schematic diagram of hydrogen bonding

2.2 相容性分析

图4示出P(3HB-co-4HB)和P(3HB-co-4HB)/SA (SA质量分数为6%)纤维膜的差示扫描量热(DSC)曲线。可以看出，P(3HB-co-4HB)的玻璃化转变温度为-12.09 ℃，P(3HB-co-4HB)/SA纤维膜出现2个玻璃化转变温度，分别为-12.09和-4.37 ℃。原因可能是：P(3HB-co-4HB)与SA为不相容体系，可借助乳化剂APG形成稳定溶液，但在成形过程中可能会产生微相分离，其中一相为P(3HB-co-4HB)，对应玻璃化转变温度-12.09 ℃；另一相为P(3HB-co-4HB)与SA的复合相，对应玻璃化转变温度-4.37 ℃，产生复合相的原因是SA分子刚性较强，其可发生相对分子质量的伸展，但不能有效的形成链缠结，导致空间位阻变大，玻璃化转变温度升高。由此可推断，APG实现了P(3HB-co-4HB)与SA的部分相容。

图4 P(3HB-co-4HB)和P(3HB-co-4HB)/SA的DSC曲线Fig.4 DSC curves of P (3HB-co-4HB) and P(3HB-co-4HB)/ SA

2.3 纤维形貌和孔隙率分析

图5示出P(3HB-co-4HB)/SA纳米纤维膜的扫描电镜照片。表1为其相对应的直径和孔隙率测试结果。由图5和表1可知，在SA质量分数小于或等于8%时，P(3HB-co-4HB)/SA纤维的直径随着SA质量分数的提高而增大，之后随SA质量分数的增大有减小趋势，当SA的质量分数为6%时，纤维形态最好，纤维直径分布比较均匀集中，没有明显的珠粒现象，纤维的平均直径为500 nm。当SA的质量分数大于8%时，纤维出现明显的异质化、断丝和缠结，这是由于SA质量分数过高，体系黏度增大，分化作用减小、可纺性变差。由表1还可见，纤维膜的孔隙率随着SA质量分数变化呈现先减小后增大趋势，在SA质量分数为10%时达到最大值89%，这是因为直径比较小的纤维具有大的比表面积，更易产生芯吸效应，从而吸附水分子，使孔隙率变大。但当SA质量分数为12%时，因为形成了过多的珠粒，占据了较大的体积，所以导致纤维膜孔隙率有所下降。高的孔隙率有利于细胞的培养，同时也可作为营养物质及新陈代谢的通道。

图5 不同SA质量分数纤维膜的扫描电镜照片(×5 000)Fig.5 SEM images of fiber membrane with different SA mass fractions(×5 000)

表1 不同SA质量分数纤维膜的直径和孔隙率Tab.1 Average diameter and porosity of fiber membrane with different SA mass fractions

2.4 细胞毒性分析

表2示出纤维膜对神经细胞增殖影响。

表2 不同SA质量分数纤维膜浸提液的吸光度值Tab.2 Optical density values of fiber membrane with different SA mass fractions

由表2可以看出，P(3HB-co-4HB)纳米纤维虽然无毒，但其浸提液的分级几乎都为1级，而P(3HB-co-4HB)/SA纤维膜浸提液的细胞相对增殖度均大于90%，为0级和少量的1级，不具有细胞毒性。可认为P(3HB-co-4HB)/SA纳米纤维具有良好的细胞相容性和生物安全性，能作为医用材料。

2.5 细胞体外培养形貌分析

图6为P(3HB-co-4HB)和添加不同SA质量分数P(3HB-co-4HB)/SA纤维膜体外细胞培养扫描电镜照片。对比可见，加入SA的膜的细胞数量明显增多，细胞伸出了较多的伪足,且呈现出扁平的形态，紧密地贴附在材料表面。产生这种现象的原因与P(3HB-co-4HB)/SA纤维膜中SA的质量分数相关，即SA的质量分数越高，材料的生物相容性相对越好，越有利于细胞的生长、粘附。

图6 不同SA质量分数纤维膜的体外细胞培养 扫描电镜照片(×500)Fig.6 SEM images of vitro cell culture of fiber membrane with different SA mass fractions(×500)

3 结 论

本文利用烷基糖苷(APG)成功地将聚羟基脂肪酸酯(P(3HB-co-4HB))和海藻酸钠(SA)复合在一起，二者之间可形成稳定的乳液。当SA质量分数为6%时，纤维平均直径为500 nm，纤维表面致密光滑。与P(3HB-co-4HB)纤维膜相比，加入一定量SA的纤维膜的浸提液的分级均大于90%，毒性几乎都为0级，不具有细胞毒性且可促进细胞增长的作用，SA质量分数越高，越有利于细胞在P(3HB-co-4HB)/SA纳米纤维表面的生长、粘附，P(3HB-co-4HB)/SA复合纤维膜较P(3HB-co-4HB)纳米纤维膜有更好的细胞相容性和生物安全性。