当归芍药散含药血清对脂多糖诱导的RAW 264.7细胞炎症因子及信号通路的影响

刘卫红 贾丽超 张蕾 康群甫 周明学

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是目前占中国城乡居民总死亡原因首位的心脑血管疾病最主要的病理基础，是一个多因素、多阶段的慢性炎症过程，发病机制复杂，至今尚未完全阐明。新近研究表明，肠道菌群衍生物脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)通过介导炎症反应促进了动脉粥样硬化的发展[1-4]。因此，研究抑制慢性炎症损伤的药物对AS的治疗可能具有潜在的临床应用价值。

动脉粥样硬化的中医病机主要为痰、瘀、虚。当归芍药散出自《金匮要略》，除了治疗各种妇科疾病的“妇人腹中诸疾痛”外，还被广泛应用于内、外、神经、皮肤、男、五官、眼等临床各科疾病。当归芍药散“血水同治”的组方特点，与动脉粥样硬化的病机特点相一致。有研究表明，当归芍药散具有改善脂代谢紊乱的作用[5-8]，本课题组前期研究[9-10]已证实当归芍药散可以显著降低代谢性炎性小鼠血脂和炎性因子水平。

因此，本研究用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症模型，观察当归芍药散含药血清对炎症因子及信号通路的影响，明确当归芍药散的抗炎作用并阐明其内在机制。在中医异病同治理论指导下，扩大经典名方的应用范围，为其防治动脉粥样硬化的临床应用提供可靠的实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株

小鼠巨噬细胞RAW 264.7购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

1.2 药物与试剂

当归芍药散组成：泽泻80 g、当归30 g、赤药160 g、川芎30 g、茯苓40 g、白术40 g。中药饮片由北京中医医院中药房提供，制剂中心制备成散剂。

当归芍药散含药血清的制备：SPF级Waster大鼠，雄性，40只，体重(200+10)g，随机分为空白组和给药组，每组各20只。给药组按成人临床等效剂量直接折算成大鼠用量，大鼠每日给药剂量为0.44 g/kg,每天给药两次，连续给药4天，第5天给药后1～2小时(给药前禁食不禁水12小时)，用0.6%的戊巴比妥钠麻醉，1 mL/100 g，腹主动脉取血，室温静置2小时进后，3000 r/min离心10分钟，无菌分离血清，56 ℃灭活30分钟，-80℃保存。使用时，以DMEM不完全液稀释为所需浓度。空白对照组每天给同等剂量的溶质(蒸馏水)，给药剂量及给药时间同给药组。

LPS(美国Sigma 公司，批号L2550)；白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6,批号558301)、单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein 1,MCP-1,批号558342)试剂盒均购自北京利文商贸有限责任公司；Cell Counting Kit-8(Dojindo Laboratories公司，批号C5531)，一抗核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB) Rabbit mAb (Cell Signaling公司，批号ab3301)；一抗过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor γ,PPARγ) Rabbit mAb (Cell Signaling公司，批号ab2908)；Anti-Beta Actin，Rabbit Pab(批号ab2100)、Dylight 800-goat anti-rabbit lgG(批号c2511)、Prestained Protein Ladder(批号c2300)均购自北京冠星宇科技有限公司；5X蛋白上样缓冲液(批号p0002)、蛋白定量试剂盒(批号23227)购自北京普利莱基因技术有限公司；RNA试剂盒(批号N160121P)、RT-PCR试剂盒(批号P160211G)购自成都福际生物技术有限公司；DNA ladder (Solarbio公司，批号160215)。

1.3 仪器与设备

倒置荧光显微镜(Nikon，T1000)，电泳仪(批号Therno scien-tific Mini，Ge Tank)，转膜仪(Therno scientific，Mini Blot Module)，酶标仪(Therno scientific MultiSkan3)，流式细胞仪BD FACSVerseTM(美国BD公司Callibur II 型)。

1.4 细胞培养及分组

小鼠巨噬细胞RAW 264.7用DMEM培养基(含10%胎牛血清)在5% CO2、37℃条件下传代培养。用0.25%的胰酶消化RAW 264.7细胞，台盼蓝染色鉴定细胞活率≥95%，调整细胞浓度为1×109/L，每孔1 mL接种到24孔培养板内，待细胞生长至80%汇合状态后，分为正常对照组、LPS诱导组、空白血清组、空白血清+LPS组、含药血清组和含药血清+LPS组。

1.5 干预方法

正常对照组：将RAW 264.7细胞用DMEM培养液培养，未施加任何处理因素，为正常对照组。LPS诱导组：将RAW 264.7细胞加入1 μg/mL的LPS，诱导24小时；空白血清组：将RAW 264.7细胞分别加入浓度为10%、20%空白血清，共同诱导24小时；空白血清+LPS组：将RAW 264.7细胞分别加入浓度为10%、20%的空白血清，孵育2小时，然后加入LPS(最终浓度为1 μg/mL)，进行刺激，共同诱导24小时；含药血清组：将RAW 264.7细胞加入浓度为10%、20%的含药血清，共同诱导24小时；含药血清+LPS组：将RAW 264.7细胞加入浓度为10%、20%的含药血清，孵育2小时，然后加入LPS(最终浓度为1 μg/mL)，进行刺激，共同诱导24小时。干预结束后，用胰酶消化，收集各组细胞进行以下实验。

1.6 检测指标

1.6.1 CCK-8法检测细胞生长活力 将细胞接种于96孔板，培养24小时后，加入各组药物进行诱导，培养18小时后，每孔加入CCK-8液(0.2 g/mL)20 μL，继续培养4小时。酶标仪检测各孔A值(λ=570 nm)，细胞存活率(%)=处理组OD值/对照组OD值×100%。

1.6.2 流式细胞术检测细胞因子IL-6、MCP-1水平 待各组细胞药物干预结束后，收集细胞上清液，1000 rpm，离心5分钟，取上清，冻存于-80℃。用反应稀释液将细胞因子标准品按照梯度法稀释为12个质量浓度。每个测试分别吸取4种捕获微球各1 μL，成为混合捕获微球，加入洗液0.5 mL，离心后去上清，用捕获微球稀释液重悬微球,室温下孵育15分钟。每个测试各取1 μL的每种微球与4种PE标记的检测抗体混合。取待测细胞上清液和标准品各50 μL，加入50 μL混合捕获微球, 室温避光孵育1小时，加入检测抗体50 μL，室温避光孵育2小时，洗2次后每管加入300 μL洗液重悬微球，4小时内上机检测。

1.6.3 RT-PCR法检测PPARγ、NF-κB mRNA表达 (1)样品的制备：各组RAW 264.7细胞加入刺激物后继续培养24小时。组织总RNA提取：用超纯RNA提取试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取组织样本中总RNA。检测RNA的纯度和含量，分析总RNA完整性，取OD260/OD280为118-210的RNA用于反转录。反转录制备模板CDNA：将RNA模板、引物、5xRT Buffer 和RNase-free Water溶解，置于冰上备用。向反应管中加入反应体系20 μL，2 μL Primer mix，RNA 10 μL，65℃孵育5分钟，冰浴2分钟，离心。继续向以上反应管中加入以下试剂：1 μL HiFi-MmLV Enzyme Mix、2 μL 0.1 MDTT、4 μL 5x RT Buffer、1 μL 10m MdNTP Each，混匀，37℃孵育50分钟，70℃保温10分钟。反应结束后的cDNA放置于-20℃保存。见表1。(2)目的基因的PCR扩增：扩增程序：95° 10分钟，(95℃15秒，60℃60秒)×45个循环。Real Time反应体系为：2 μL模板；0.4 μL上游引物(10 μM)；0.4 μL下游引物(10 μM)；10 μL 2×UltraSYBR Mixture。加入灭菌蒸馏水至20 μL。PCR产物分析：取5μL RNA，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶图像分析系统(Gel2Pro Analyzer Version 310)分析结果，以β-actin校正作相对量分析，结果以两者之间吸光度的比值表示。

表1 各引物序列

1.6.4 Western Blot法检测PPARγ、NF-κB蛋白表达 RAW 264.7细胞加入刺激物后继续培养24小时。提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取样品50 μg，煮沸变性后进行SDS2PAGE电泳(5%的浓缩胶和10%的分离胶)，转膜，5%的脱脂奶粉37℃封闭1小时，加入PPARγ、NF-κB，4℃孵育过夜，洗膜，加HRP标记的相应二抗37℃孵育1小时，ECL法显影,分析条带灰度值，以目的条带与β-actin条带的灰度比值来表示蛋白相对表达量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 CCK-8法检测LPS和不同浓度当归芍药散含药血清对RAW 264.7细胞生长活力的影响

其他各组的RAW 264.7细胞生长活力与正常对照组比较，均无统计学差异(P>0.05)。可见1 μg/mL的LPS和10%、20%的当归芍药散、10%、20%的空白血清均未对细胞生长活力造成影响。结果见表2。

表2 CCK-8法检测LPS和不同浓度当归芍药散含药血清对各组细胞生长活力的影响

2.2 当归芍药散含药血清对LPS诱导的RAW 264.7细胞细胞因子的影响

与正常对照组相比，LPS诱导组细胞上清中IL-6和MCP-1水平均明显升高(P<0.05)。与10%空白血清+LPS组比较，10%当归芍药散含药血清+LPS组中IL-6和MCP-1水平明显降低(P<0.05)；与20%空白血清+LPS组比较，20%当归芍药散含药血清+LPS组中IL-6和MCP-1水平明显降低(P<0.05)。可见10%、20%当归芍药散含药血清可降低LPS诱导的RAW 264.7细胞上清中细胞因子IL-6和MCP-1的水平。结果见表3。

表3 当归芍药散含药血清对LPS诱导的RAW 264.7细胞细胞因子IL-6、MCP-1表达的影响

2.3 RT-PCR法检测当归芍药散含药血清对PPARγ、NF-κB mRNA表达的影响

与正常对照组比较，LPS诱导组中NF-κB mRNA水平明显升高(P<0.05)，PPARγ mRNA水平明显降低(P<0.05)。与10%空白血清+LPS组相比，10%当归芍药散含药血清+LPS组中NF-κB mRNA水平明显降低(P<0.05)，PPARγ mRNA水平明显提高(P<0.05)。结果见表4。

表4 当归芍药散含药血清抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞NF-κB、PPARγ mRNA表达情况

2.4 Western Blot检测当归芍药散含药血清对NF-κB、PPARγ蛋白表达的影响

与正常对照组相比，LPS诱导组中NF-κB蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，PPARγ蛋白水平明显降低(P<0.05)。与10%空白血清+LPS组相比，10%当归芍药散含药血清+LPS组NF-κB蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，PPARγ蛋白水平明显提高(P<0.05)。结果见图1、表5。

注：A：正常对照组；B：LPS诱导组；C：10%空白血清组；D组：10%空白血清+LPS组；E：10%含药血清组；F：10%含药血清+LPS组。

表5 当归芍药散含药血清抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞NF-κB和PPARγ蛋白的表达情况

3 讨论

目前，肠道菌群在心血管疾病发病中的作用备受关注。新近研究表明，肠道菌群引起的肠心轴失衡在动脉粥样硬化的进展中起着重要作用[11]。肠道菌群失衡会产生许多有害物质，包括LPS、TMAO、PAGln，并减少短链脂肪酸，尤其是丁酸的产生[12-13]。另外，菌群构成比例的失调可以导致肠道粘膜屏障功能受到破坏，增加肠道上皮的通透性，从而使脂多糖由肠道入血增多，产生“代谢性LPS血症”，并诱发全身性炎症[14]。

LPS被细胞表面的Toll样模式识别受体识别，通过胞内一系列信号转导途径导致免疫炎症反应，最终促进AS发生[15]。当机体受到LPS刺激时，能够激活巨噬细胞合成和释放多种与炎症相关的细胞因子，包括IL-6和MCP-1等，这些细胞因子能够进一步激活体内的内皮细胞等效应细胞释放氧自由基、前列腺素、白三烯等炎症介质，导致过度炎症的发生[16]。本研究发现LPS能够增加MCP-1的表达,参与单核细胞聚集并启动炎症反应。促炎因子IL-6表达上调，扩大了AS炎症反应，导致了斑块组织损伤。

NF-κB是炎症信号转导途径中的枢纽，也是启动动脉粥样硬化的一个关键信号通路[17]，可以被TNF-α、LPS等刺激活化，是调控炎症和免疫反应分子机制中重要的抗炎途径。NF-κB在多数细胞以失活的形式存在于细胞质，当细胞受到刺激(感染、氧化和抗原等)，NF-κB的抑制蛋白IKB磷酸化，相应的蛋白酶体降解，使NF-κB激活，进入细胞核，与靶基因结合，后者可产生大量的炎症介质(如IL-1β和TNF-α)，引起炎症反应的发生，进而可以诱导AS的发生[18]。

PPARγ是巨噬细胞内的核受体，对脂质代谢和炎症反应均有调节作用。PPARγ在动脉粥样硬化过程中可抑制巨噬细胞炎症因子的释放并能促进胆固醇外流，是一个保护性基因。同时，PPARγ可抑制单核细胞/巨噬细胞转录因子NF-κB的活性，减少TNF-α、IL-6等炎症因子的表达水平，从而调节炎性反应[19]。

动脉粥样硬化的中医病机主要为痰、瘀、虚。当归芍药散出自《金匮要略》，由赤芍、泽泻、当归、茯苓、白术、川芎6味中药组成，方中以赤芍为君药，活血利水止痛，当归、川芎温通血脉，养血祛瘀，茯苓、白术、泽泻健脾利水，是活血养血、利水化痰的代表方剂。除了治疗多种各种妇科疾病外，还被广泛应用于临床各科疾病。当归芍药散“血水同治”的组方特点，与动脉粥样硬化的病机特点相一致。课题组前期从方证相应的角度反证了高脂血症及动脉粥样硬化病理过程以痰瘀互结为主要病机[20]。在中医异病同治理论指导下，深入研究当归芍药散治疗动脉粥样硬化的作用及其机制，将为其临床应用提供可靠的实验依据。

课题组前期的在体实验已经证实当归芍药散可显著降低代谢性炎症小鼠血脂水平和炎性因子MCP-1和IL-6的浓度，其作用机制可能与降低NF-κB mRNA表达并提高PPARγ mRNA表达水平有关[9]。本研究采用体外实验，探讨当归芍药散含药血清对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的干预作用。结果表明，当归芍药散含药血清可以显著降低LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症因子IL-6和MCP-1水平。进一步探讨其抗炎的机制，发现当归芍药散含药血清显著降低了NF-κB mRNA和蛋白的表达，提高PPARγ mRNA和蛋白的表达。结果表明，当归芍药散含药血清抑制炎症反应的作用可能与抑制NF-κB的活化，提高PPARγ表达水平有关，与动物实验结果一致。

综上所述，LPS可诱导RAW 264.7细胞分泌炎症因子IL-6、MCP-1水平升高，可以作为体外炎症细胞模型。本研究在前期实验的基础上，从体外实验进一步证实当归芍药散对NF-κB及PPARγ信号通路有显著的调控作用，并可降低其下游促炎因子IL-6、MCP-1的分泌水平，对代谢性炎症有明确的治疗作用，减缓了动脉粥样硬化的病理进程。