迷走神经刺激活化胆碱能抗炎通路对创伤/失血性休克的干预作用

郑紫磊 郭睿 郜思齐 张立民 张玉平

创伤/失血性休克(trauma/hemorrhagic shock，T/HS)是一种有效循环血量急剧降低引起的全身组织器官低灌注为特征的临床常见危重状态[1]。T/HS后的低灌注导致全身组织缺血、缺氧，触发全身失控性炎性反应，进而出现多器官功能障碍或衰竭甚至死亡。尽管现代医学的迅速发展使得各种治疗方案和器官支持措施得以广泛应用，但T/HS引起的病死率仍然高达20%～40%[2]。2000年Borovikova等[3]首次报道，电刺激迷走神经可显著抑制脓毒症时体内过度活化的炎性反应，延缓休克的发生。这一发现使我们认识到，中枢神经系统通过胆碱能迷走神经可对机体免疫平衡进行快速、精准调控[4]。胆碱能抗炎通路的发现在中枢神经系统和免疫功能之间建立了直接联系，机体通过胆碱能抗炎通路像神经反射一样快速调控机体的免疫平衡。T/HS后出现的全身失控性炎性反应被认为是推动病情进展的关键环节，通过各种刺激措施使迷走神经活性增加，是否可以压制全身失控的炎性反应、改善预后，已经越来越引起人们的注意。本文从胆碱能抗炎通路的解剖组成、功能特点、以及迷走神经刺激活化胆碱能抗炎通路对T/HS的影响进行综述。

1 胆碱能抗炎通路完成的抗炎反射

中枢神经系统通过神经回路可能像控制身体运动、心脏节律和身体温度一样，控制机体炎性因子的释放，调节免疫平衡。但是，迄今为止我们对于这种快速的神经反射样中枢免疫调控机制知之甚少。

Borovikova等[3]首先报道，电刺激加强迷走神经活性可以显著抑制脂多糖攻击大鼠体内TNF的水平，进而延缓休克的发生；体外，迷走神经递质乙酰胆碱可以抑制脂多糖攻击巨噬细胞炎性介质的释放。研究显示，烟碱型乙酰胆碱受体是介导巨噬细胞产生炎性因子的关键，而其中最重要的是α7烟碱样乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor-α7，α7 nAChR)[5]。随后的研究发现，选择性胆碱能受体激动剂尼古丁可抑制体外培养巨噬细胞核内HMGB1向胞浆异位，减少向胞外分泌；尼古丁可通过抑制NF-κB活化降低脓毒症小鼠体内HMGB1水平，对小鼠提供长效保护；迷走神经刺激对脂多糖攻击引起TNF释放的抑制效应，在α7 nAChR基因敲除小鼠和施行迷走神经切断术后消失[4,6,7]。随后脓毒症、缺血/再灌注、胰腺炎、炎性肠病、关节炎、心肌梗死、T/HS等动物模型都有类似的发现[8]。越来越多的证据支持，体内存在迷走神经传出纤维完成的胆碱能抗炎通路，从而对机体的炎症状态能够做出迅速而有效的反应。

考虑到神经信号的传导速度、中枢对传入信息与全身状态进行整合的特点，抗炎反射可能在机体的免疫平衡中处于核心地位[8]。通常认为，脑的室周器官(circumventricular organ，CVO)血脑屏障比较薄弱，全身炎症状态下外周血中的细胞因子和(或)内毒素可被此部位的特殊神经元发现，并将神经信号投射到脑干的自主运动神经元。但局部炎症，或血液细胞因子浓度很低时，不足以通过CVO引起神经元的活化时，细胞因子等或可通过迷走神经传入纤维将炎症信号通知中枢[9]。Goehler等[10]研究证实，雄性CF1小鼠肠道局部感染，可使血浆促炎性细胞因子出现之前，就出现双侧迷走神经节感觉神经元、脑干孤束核以及主要的内脏感觉通路神经元的c-Fos表达(活化的标志)增加。Cailotto等[11]在肠道手术操作诱发的局部炎症模型上发现通过迷走神经传入纤维引起孤束核神经元活化的证据，并且迷走神经背核运动神经元发出的传出纤维投射到肠道炎症局部的42%活化。这些研究表明机体中枢神经存在感知外周炎症的硬件连接，通过感知机体的炎症状态随时做出迅速调整，维持机体的稳态。但是，抗炎反射的传出通路有哪些，谁是效应器，我们都不清楚。

迷走神经是混合神经，为第10对脑神经。通常认为，其一般内脏运动纤维起于延髓的疑核和迷走神经背核，发出副交感节前神经纤维，在脏器内或附近的副交感神经节内换元，发出神经纤维分布于腹腔脏器。脾是脓毒血症发病过程中TNF、HMGB1等炎性细胞因子的主要产生器官，被认为是抗炎反射的主要效应器官。体外研究显示，胆碱能神经递质通过α7 nAChR受体抑制巨噬细胞炎性介质的释放，而脾脏与免疫细胞密切接触的是肾上腺素能神经末梢。Rosas-Ballina等[12]在脾脏鉴定出一种分布在肾上腺素能神经末端的产乙酰胆碱记忆性T细胞，刺激迷走神经引起脾脏内去甲肾上腺素的释放使这种记忆性T细胞产生大量的乙酰胆碱，通过α7 nAChR受体与周围的巨噬细胞发生相互作用，压制炎症的过度放大造成的自我损伤。肠是脓毒症、失血性休克、烧伤等危重状态发病过程的关键器官，肠壁存在大量巨噬细胞、T细胞、DC细胞等免疫细胞。有研究也发现，脾切除后，刺激迷走神经引起的抗炎效应仍然存在[13]。这些结果提示，肠可能是抗炎反射的另外一个重要效应器官。和脾类似，迷走神经可能也不直接对肠内的免疫细胞进行调控。通过顺行示踪技术发现，迷走神经末梢可以直接和肠神经系统的节后神经元发生突触联系。肠壁内肠神经系统在黏膜下层和肌层组成致密的神经网络，并与免疫细胞密切接触。或可推测迷走神经信号被肠神经系统放大，乙酰胆碱迅速增加，进而调节机体的免疫状态。但是，迄今为止相关证据还很缺乏。

总是，机体通过抗炎反射感知机体的免疫状态，通过迷走神经的胆碱能抗炎通路做出调整。对迷走神经的胆碱能抗炎通路进行调制可能为免疫失衡造成的机体过度炎性反应性疾病的防治提供新思路。

2 刺激迷走神经活化胆碱能抗炎通路与T/HS

目前，迷走神经刺激在临床已经应用于重度抑郁、偏头痛、药物抵抗性癫痫的治疗，并证明存在确实的疗效[14,15]，其机制可能是由刺激迷走神经改变杏仁核或海马体部位突触后密集蛋白的成分，进而调节兴奋性神经突触的活性来实现的。近年来，刺激迷走神经通过活化胆碱能抗炎通路对T/HS的干预作用也越来越受到人们的重视，并开始探索临床应用的可能。

2.1 电刺激迷走神经活化胆碱能抗炎通路 胆碱能抗炎通路的发现，也为T/HS的防治提供了新视野。Levy等[13]发现迷走神经刺激可使T/HS导致的肠道破坏、肺损伤以及嗜中性粒细胞扣押、呼吸爆发几乎恢复到正常水平。Wu等[16]报道，迷走神经刺激可显著减轻T/HS大鼠肠上皮细胞多糖包被层(epithelial glycocalyx)破坏和肠黏膜屏障的高通透状态、肠和肺的损伤以及促炎性细胞因子的水平；而这种效应可被α7 nAChR 特异性拮抗剂甲基牛扁亭(Methyllycaconitine)显著逆转。Yagi等[17]的研究显示，迷走神经刺激可显著提高T/HS大鼠肠血流量和门静脉血中去甲肾上腺素的水平。但是，不同于脓毒血症动物模型的发现，电刺激迷走神经对T/HS器官的保护作用在施行脾切除术后仍然有效。同时发现，T/HS大鼠肠淋巴液回输可引起正常动物出现急性肺损伤、嗜中性粒细胞呼吸爆发、红细胞变形能力下降；迷走神经刺激休克肠淋巴液回输未出现肺损伤，也未见白细胞和红细胞的功能改变。这些结果提示，迷走神经刺激可阻止T/HS肠道损伤，降低肠淋巴液的损伤作用，对肺等器官提供保护。Reys等[18]研究表明迷走神经刺激可阻止T/HS引起的肠组织学损伤、通透性增加和紧密连接蛋白的移位，保持肠屏障功能的完整；以及减轻肺间质增厚、炎细胞浸润、肺泡出血和透明膜形成等急性损伤性改变。手术离断胃食管交界处迷走神经与肠神经的连接，但保留入肺的神经纤维，迷走神经刺激对T/HS后肠和肺的保护作用都消失了。因此提出，迷走神经刺激对T/HS器官的保护作用是通过“神经-肠-肺”轴机制实现的[18]。迷走神经刺激对T/HS器官的保护作用是通过维持肠屏障的完整性，减少肠源性的损伤因子移位入血造成的炎症风暴，进而对肺等器官提供保护。越来越多的证据显示，一直被忽视的肠淋巴液正是迷走神经刺激与肠外器官保护作用的中介环节[13]。但是，迷走神经刺激如何改变或者调制休克肠淋巴液的活性成分，以及是何活性成分引起了远隔部位的器官损伤或者功能保护，仍然有待进一步探讨。大量的学者从炎性介质、病原成分、蛋白质组以及脂质组学的改变进行了深入探索。最近的研究开始关注于免疫细胞谱系的改变和外泌体的作用。

肠道CD103+树突状细胞可以迁移入淋巴结，对T细胞的适应性免疫进行调节。T细胞在不同的微环境中可分化为辅助性T细胞(T-helper，Th)1、Th2、Th17以及调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)。Th17细胞定居于肠黏膜屏障之下，通过产生IL-17、IL-22等促炎性细胞因子，可消灭入侵到上皮层下的致病微生物。Treg细胞是一种具有免疫抑制作用的T细胞亚群，可特异性表达转录因子Foxp3，也主要定居在肠黏膜内，可限制效应性T细胞的过度活化，从而防止免疫反应时的自我损伤。Morishita等[19,20]研究发现，T/HS后肠淋巴液和肠系膜淋巴结中CD103+树突状细胞显著下降，肠系膜淋巴结内CD4+Foxp3+细胞显著减少、而CD4+IL-17+细胞显著增加，并且同一个淋巴结内Treg与Th17细胞比值迅速降低；迷走神经刺激可增加休克肠淋巴液内CD103+树突状细胞数量，恢复肠系膜淋巴结内Treg细胞水平，稳定Treg与Th17细胞间的平衡。这些结果提示迷走神经刺激可通过肠道CD103+树突状细胞来调节Treg与Th17之间的平衡，重新设定T/HS后免疫过程的损伤与耐受，从而抑制过度失衡的炎症风暴。

外泌体(Exosome)是指直径在30～150 nm细胞外囊泡，其主要来源于细胞内的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌，进而发挥多样性的生物学作用。血液、尿液、脑脊液、腹水和淋巴液中均可分离得到。外泌体内装载有包括蛋白、脂质、mRNA和miRNA在内的各种成分，所有这些成分都可能具有生物活性并能够调节包括炎症反应和氧化应激在内的各种生命过程[12]。外泌体可以通过参与炎症过程从而在癌症、糖尿病、肥胖、类风湿性关节炎、神经退行性疾病等病理过程中发挥重要的作用。研究表明，免疫细胞可以摄取其他细胞分泌的外泌体并触发炎症反应，例如急性结肠炎小鼠的血清外泌体可以激活巨噬细胞，上调其MAPK信号通路并释放TNF-α[22]，此外，中性粒细胞、DC细胞等也可以被外泌体刺激参与炎症反应[12]。Kojima等[24]报道，与休克前比较，SD大鼠休克期肠淋巴液内外泌体的含量上升2倍，而复苏期减少了4倍。然而，与淋巴液上清相比，复苏期分离的外泌体的生物活性明显增加，可导致单核细胞NF-κB活化增加8倍；而且，复苏期收获的外泌体处理后的巨噬细胞产TNF-α能力显著增加。在外泌体内容物中，多种成分可参与刺激受体细胞发生炎症反应。例如在癌症、细菌感染等疾病的外泌体中，HSP70蛋白水平显著升高，并能通过激活免疫细胞的NF-κB通路、释放NF-α、上调IFN-γ 和IL-13表达从而引起炎症反应[25]。在肺癌中，肿瘤分泌的外泌体miR-21和mi-R29a可以与免疫细胞中Toll样受体结合来触发炎症反应[26]。因此，外泌体内容物变化在多种疾病中炎症的发生中发挥重要作用。Williams等[27]蛋白质组学的分析表明，T/HS肠淋巴液外泌体蛋白表达谱表现为富集于细胞信号、细胞存活与死亡和炎性反应等信号通路的特征；迷走神经刺激显著抑制了T/HS诱导的淋巴液外泌体蛋白表达向炎症表型转化的改变，甚至接近于休克前的状态。体外实验证实，休克淋巴液外泌体显著增加单核细胞NF-κB的表达；而迷走神经刺激后收集的休克淋巴液外泌体对单核细胞NF-κB的表达几乎与休克前的外泌体无差别。这些数据表明，大鼠T/HS后外泌体不但发生含量的调整，更存在装载内容物的变化，这种变化可能是休克淋巴液造成远隔部位器官功能障碍或损伤的重要原因，而迷走神经刺激可显著逆转这种损伤性改变。此外，迷走神经刺激是否也可以调制外泌体内脂质以及mRNA和miRNA在内的其他成分参与休克的器官保护作用，有待进一步证实。

电刺激迷走神经对T/HS的保护机制可能是通过增加肠道CD103+树突状细胞数量来调节Treg与Th17之间的平衡，抑制T/HS后免疫细胞过度活化引起的炎症风暴，进而保护肠道，降低T/HS肠淋巴液的损伤性活性，减轻肺、心、肾等远隔器官的损伤[28]。但是，迷走神经刺激调制休克肠淋巴液的细胞和分子机制，以及迷走神经刺激保护休克器官免受损伤的具体效应分子都有待进一步的确定。这一系列问题的解决将为临床相关疾病的治疗提供新思路。

2.2 药物刺激迷走神经活化胆碱能抗炎通路 尽管直接电刺激迷走神经在临床已有应用，但作为一种侵入性操作给予T/HS患者将有很多限制。Guarini等[29]发现，促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropin，ACTH)静脉注射可引起T/HS大鼠迷走神经传出纤维活性在几分钟内迅速增加，10～15 min达到高峰，这一效应可以稳定持续>30 min，而ACTH不会引起正常动物出现类似效应。同时发现，ACTH可以使T/HS大鼠生存时间显著延长，血浆NF-κB转录活性、TNF-α含量恢复到基线水平。进一步的机制探讨中发现，ACTH的抗休克作用可被双侧迷走神经离断、选择性黑色素皮质激素MC4受体阻断剂HS014、硫酸阿托品所阻断；而不能通过血脑屏障的溴化甲基阿托品无此作用。因此推测ACTH可通过中枢机制引起迷走神经传出活性增强，活化胆碱能抗炎通路，抑制炎症瀑布，进而对T/HS大鼠提供保护。Morishita等[30]报道，T/HS大鼠静脉给予鸟嘌呤衍生化合物CPSI-121后，迷走神经放电显著加强，并可持续>30 min；肠道组织学损伤几乎恢复到正常水平；肠淋巴液对嗜中性粒细胞的触发效应迅速下降；肺组织损伤积分回落、水肿减轻。同时，也发现CPSI-121对炎症肠道的保护作用在迷走神经传出纤维肠支手术离断后消失[31]。随后Langness等[32]证实CPSI-121治疗可显著减轻休克肠淋巴液回输引起的正常小鼠全身性低血压状态和以信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，Stat3)高磷酸化为特征的单核细胞活化；并且，以肺泡出血、气道水肿为特征的肺组织形态学损伤，肺组织高通透性和炎细胞浸润也显著缓解。这些结果提示，CPSI-121可以通过增强迷走神经活性保护肠道，减少休克肠淋巴液的损伤活性，对肺等全身脏器提供保护作用。此外，与CPSI-121具有相似结构基础的其他鸟嘌呤衍生化合物CPSI-2364[33]、CNI-1493[34]是否也有相似的迷走神经活化的作用，还未见报道。

2.3 肠内高脂营养刺激迷走神经活化胆碱能抗炎通路 肠道内营养物质与自主神经的相互作用在机体的消化、免疫和代谢功能调节中具有非常重要的作用。越来越多的研究显示，高脂肠内营养可活化迷走神经，通过胆碱能抗炎通路抑制机体的炎性反应[35-39]。Lin等[39]观察发现，肠内高脂营养可显著减轻休克肠促炎性细胞因子、运动能力以及肠黏膜屏障功能损坏的程度。Luyer等[36]发现，T/HS前45 min给大鼠肠内高脂营养(52%脂肪、41%碳水化合物和7%蛋白)可使肠屏障通透性、远隔器官细菌移位、血浆内毒素、TNF-α和IL-6水平显著降低；而这些效应可被辣椒素迷走神经传入纤维毁损、迷走神经离断术所拮抗。通常，不同的肠内营养成分可通过不同的机制活化自主神经，高脂饮食可引起肠促胰酶肽(cholecystokinin，CCK)分泌，目前认为CCK可能是肠内高脂营养活化迷走神经的关键环节。相关实验都发现，CCK-1和CCK-2受体阻断剂均可对抗肠内高脂营养对T/HS大鼠肠道完整性和全身炎性反应的保护效应[36,37]。但Lubbers等[37]的实验进一步证实，CCK-1受体拮抗剂devazepide的拮抗效应显著强于CCK-2受体拮抗剂L365,260；并且，外周使用不能通过血-脑屏障的CCK-1受体拮抗剂A70104能够完全废除肠内高脂营养对T/HS大鼠肠道完整性和全身炎性反应的保护效应；给予外源性CCK-1受体激动剂PEG-CCK9能模拟肠内高脂营养降低T/HS大鼠肠通透性、细菌移位、TNF-α和IL-6水平的效应；而A70104可显著抑制PEG-CCK9的对T/HS大鼠肠道或炎症水平的保护效应。这些发现提示，肠内高脂营养引起肠道CCK释放，通过外周CCK-1受体触发迷走神经传入纤维放电，进而活化胆碱能抗炎通路的肠道保护效应。随后的研究发现，T/HS后早期和晚期治疗性给予肠内高脂营养均可通过CCK受体依赖的方式抑制肠道局部炎症、减轻肠道损伤、降低全身循环血中IFN-γ和IL-10水平以及细菌/内毒素移位[39]。这些结果提示，肠内高脂营养可能会成为一种通过活化胆碱能抗炎效应防治T/HS的优选方案。

总之，迷走神经刺激引起的抗炎反射在T/HS的发生发展过程发挥重要作用。T/HS的发展过程中，分布在腹腔脏器的迷走神经传入纤维感受机体微环境的变化，将信号传递给脑，脑内中枢不同核团对信息进行整合后，通过迷走神经传出纤维重新设定肠道免疫反应调定水平，即耐受和损伤的平衡机制，进而由肠淋巴液将损伤和耐受的效应分子传递给肺、肾、肝、心等各个脏器。因此，以机体抗炎反射的各个环节为靶点，活化迷走神经启动胆碱能抗炎通路，将从整体水平控制全身炎性反应的瀑布级联效应，避免单个的拮抗因子对抗整个炎症网络的无效结局，将为T/HS的防治提供新思路。