水产品中食源性病原菌多重PCR快速检测方法的建立

母润红，聂丹丹，李明成，马 丽，赵 明，高丽君，刘晓蓉

(1.北华大学基础医学院，吉林 吉林 132013；2.长春海关技术中心，吉林 长春 130021；3.北华大学医学技术学院，吉林 吉林 132013)

据世界卫生组织统计结果[1]显示：每年大约有60%～70%食源性疾病是由食源性病原体引起的，并且食物中毒人数逐年增多，因此，食品安全是迫切需要解决的问题.水产品在捕捞、储藏、加工、运输过程中等易受到病原微生物的污染，水产品中食源性病原菌的准确、快速检测是保证其食品安全的首要措施.建立针对水产品中沙门氏菌、单细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌的快速检测方法，对我国食品安全具有保障作用.细菌性病原体传统的检测方法有细菌培养周期长、操作步骤繁琐、耗时等缺点，很难满足食源性病原体快速检测的需求[2].多重PCR检测技术具有高效、灵敏、准确的特点，利用分子生物学技术可同时检测多种致病菌，节约时间，提高效率，已广泛应用于食源性致病菌的检测[3-5].目前，国内外对多种食源性致病菌的多重PCR检测方法也有报道，但针对同时鉴定水产品中4种病原菌的多重PCR研究鲜有报道.

本试验对设计特异性引物和多重PCR退火温度反应条件等进行优化，以探索能同时检测沙门氏菌、单细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌的多重PCR技术，为水产品中病原菌的快速检测提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

目标菌株：沙门氏菌(ATCC 12011)、单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC 19111)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、霍乱弧菌(JL.08108).非目标菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC 12600)、猪霍乱沙门氏菌(ATCC 13311)、李斯特菌(ATCC 19119)、普通变形杆菌(ATCC 33420)、小肠耶尔森菌(ATCC 23715)、大肠埃希氏菌(ATCC 11229)、克雷伯氏菌(ATCC 43086)、粪肠球菌(ATCC 14500)、蜡样芽孢杆菌(ATCC 11176)、志贺氏菌(JL08036)和阴沟肠杆菌(ATCC10146)(长春海关技术中心)；天根细菌DNA 提取试剂盒、10×Buffer和DL2000 DNA Marker(TaKaRa 公司，日本)；核酸检测仪和高速离心机(Sigma 公司，美国).

1.2 引物设计合成及DNA提取

选择沙门氏菌的侵袭蛋白基因invA、单核细胞增生李斯特菌prfA、副溶血性弧菌tlh和霍乱弧菌ompW4为靶基因，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件按照多重PCR引物设计原则设计4对引物.见表1.各引物均由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成.目标菌和非目标菌均采用LB液体肉汤培养基，36 ℃培养18 h，震荡培养，取1 mL菌液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒要求进行提取，将提取的DNA作为模板，-20 ℃保存备用.

1.3 单重PCR扩增及敏感性试验

应用超微量分光光度计NanoDrop 2000 测定已提取的目标菌沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌基因组的DNA浓度，用无菌生理盐水进行系列10倍梯度稀释，109～100cfu/mL为模板，进行靶基因invA、prfA、tlh和ompW的单重PCR扩增和敏感性检测.单重PCR反应体系25 μL：2×Taq Master Mix 12.5 μL，引物浓度为0.5 μmol/L，模板 2 μL，蒸馏水 10 μL，退火温度58 ℃ 48 s，取PCR 扩增产物观察分析目的条带大小和最低限度检测值.

1.4 多重PCR退火温度优化

设计温度梯度PCR扩增程序，退火温度依次为52、54、56、58、60 ℃，筛选出最适宜的退火温度.

表1 引物序列及扩增片段长度Tab.1 Primer sequence and amplified fragment length

1.5 多重PCR特异性试验

以金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌、李斯特菌、普通变形杆菌、小肠耶尔森菌、大肠埃希氏菌、克雷伯氏菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、阴沟肠杆菌的DNA及4种目标菌的混合基因组DNA为模板，采用退火温度优化后的多重PCR进行扩增，验证引物的特异性.

1.6 多重PCR敏感性试验

应用超微量分光光度计NanoDrop 2000 测定4种病原菌基因组 DNA浓度，用无菌生理盐水进行系列10倍梯度稀释，以109～100cfu/mL为模板，取1 mL各浓度菌液提取基因组DNA，进行多重PCR敏感性试验.

1.7 多重PCR对人工污染的鱿鱼检验试验

应用建立的多重PCR对人工污染鱿鱼进行检测.具体方法：20 g鱿鱼样品，置于200 mL LB肉汤液体培养基中，36 ℃震荡培养18 h，采用细菌基因组DNA试剂盒提取DNA作为模板，添加4种目标菌和非目标菌进行样品特异性检测.

2 结 果

2.1 单重PCR扩增及敏感性检测结果

将4种目的菌株模板进行单重 PCR 特异性扩增及灵敏度检测.结果显示：沙门氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌均能扩增出对应大小目的片段，invA基因结果扩增出特异性片段为198 bp，tlh为450 bp，ompW为588 bp，prfA为274 bp.同时检测出沙门氏菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌最低检测极限为1×104cfu/mL，仅单核细胞增生李斯特氏菌最低检测极限为1×107cfu/mL，表明单重PCR检测方法具有较高的检测灵敏度.见图1.

2.2 多重PCR退火温度优化结果

由图2可以看出：退火温度对多重PCR扩增效果的影响很明显，退火温度在52～58 ℃时均能扩增出4条清晰的目的条带；但温度在60 ℃时，沙门氏菌未能扩增出目的片段，其中以退火温度为54 ℃(泳道2)时各菌株目的基因的扩增效率稍高，且较均衡，故选择54 ℃为该多重PCR的最佳退火温度.优化后的多重PCR反应体系：模板DNA 8 μL(各个菌DNA模板各2 μL)，4种引物各2 μL，2×Taq Master Mix 14.5 μL，总体积45 μL.退火温度54 ℃ 45 s.结束反应，4 ℃保存，30 min后通过琼脂糖凝胶紫外成像分析系统记录并保存.

2.3 多重PCR特异性试验结果

优化后的PCR反应体系通过单管多重PCR检测4株目的菌特异性，每管加入4种、3种、2种和1种混合基因组DNA，均能扩增出特异性目的片段.见图3.

2.4 多重PCR灵敏度试验结果

采用无菌生理盐水系列 10 倍梯度稀释(109～104cfu/mL)4株目的菌DNA作为模板，进行多重 PCR 灵敏度检测.结果显示：建立的多重PCR方法最低检测极限为1×104cfu/mL，表明多重PCR 检测方法具有较高的检测灵敏度.见图4.

2.5 多重PCR对人工污染的鱿鱼检验结果

应用优化后的多重PCR技术对人工污染鱿鱼的9株非目标菌株基因组DNA及4种目标菌的混合基因组DNA进行检测，结果显示：沙门氏菌在198 bp处出现扩增片段，单增李斯特菌在274 bp处出现扩增片段，副溶血性弧菌在450 bp处出现扩增片段，霍乱弧菌在588 bp处出现扩增片段，且4种目的菌株条带清晰，无非特异性扩增条带；而非目的菌株的基因组DNA均未扩增出任何条带，表明这4对引物无相互干扰且特异性较好，由此表明建立的多重PCR可用于同时检测1种或4种致病菌.见图5.

3 结 论

食源性细菌性病原菌引发的食源性疾病对人们的生活造成了严重影响[6-7]，进口食品也存在此类风险.近年来，我国在食品安全标准、技术水平、设备设施建设方面做出了相应改革，进出口食品检验检疫要求也更加严格[8]，并向着制度化、体系化方向发展.因此，我国在食品安全方面采用先进技术进行精准检测更为重要.

多重PCR(multiplex PCR，mPCR)反应技术是以单一PCR反应为基础，在一个PCR反应体系中进行两种以上的特异性PCR扩增技术，整个试验操作过程与常规PCR反应技术相同，其优点是在相同的时间里，一个反应体系可以检测出多种病原体，并实现该技术的放大化[9-11].

本试验将4种标准株沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌特异靶基因invA、prfA、tlh和ompW作为研究对象，设计特异性引物，分别对4种菌特异性引物进行筛选，选择适宜的特异性引物，筛选单重PCR扩增条件.影响多重PCR扩增因素较多，将单重PCR扩增反应体系进行优化，探索多重PCR退火温度，以建立多重PCR检测方法.通过检测4株目的菌珠的特异性、敏感性及人工污染鱿鱼检验的结果表明：所建立的多重PCR敏感性最低检测值为1×104cfu/mL，具有较好的灵敏性.选取9株非目的菌珠和4株目的菌株通过LB液体培养后，采用细菌基因组试剂盒提取基因组，设计引物，并进行特异性检测.本试验结果显示：目的菌珠均能扩增出大小相同的基因片段，非目的菌珠未见条带，而且无交叉反应出现，表明该方法的特异性高，方法具有可信性.人工添加目的菌的鱿鱼也能扩增出大小相同的目的菌株片段，表明此方法可用于水产品检测.因此，本试验建立了多重PCR方法可用于食源性细菌性病原菌的检测.

本试验建立的多重PCR方法简便易行，结果准确，可用于食源性细菌性病原体的检测，为我国的食品安全提供可靠保障.