含RGD肽类弹性蛋白制备及促HUVECs细胞黏附的影响

崔梅英，王明月，陈 丽，王冬梅，杨泽斌，黄莉莉，刘宇轩，关新刚

(北华大学医学技术学院，吉林 吉林 132013)

弹性蛋白(Elastin)存在于所有脊椎动物组织中，是负责维持组织(如心脏、皮肤、血管、软骨等)弹性的一类细胞外基质蛋白[1]，类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides，ELPs)借鉴弹性蛋白前体结构组成以五肽串联重复序列单元(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，VPGXG，Xaa可以是除了脯氨酸以外的任意一种氨基酸)为基本结构单位的人造多肽聚合物[2].ELPs具有温度敏感的可逆相变特性，在低于相变温度溶液中呈可溶状态，在高于相变温度溶液中呈凝集状态，而且此过程是可逆的，该特性使ELPs获取过程更为简便、快捷[3-4].ELPs具有理想的机械化学特性、良好生物相容性及可降解性特点，能够通过基因工程方法进行高通量生产，使其成为理想的新型生物医学材料[5]，受到生物材料界学者的普遍青睐，成为极具应用前景的生物材料分子之一.

ELPs的机械弹性及完全可降解性提供了一个模拟天然细胞环境的完美人工平台，RGD肽是一系列含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp) 的多肽片段[6]，广泛存在于纤连蛋白、层粘连蛋白等多种细胞外基质中，介导细胞与细胞外基质的黏附作用[7].近年来，人工合成的RGD肽在组织工程和肿瘤靶向等研究领域引起了广泛关注[8-9].本研究中，我们表达纯化了含RGD肽的类弹性蛋白(RGD-ELPs)及对照蛋白RDG-ELPs，探讨两种融合蛋白的细胞相容性，比较分析两种融合蛋白对人脐静脉内皮细胞HUVECs黏附表达的影响.

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和主要试剂

pET15b-RGD-ELPs和pET15b-RDG-ELPs质粒(美国斯坦福大学Sarah C H教授惠赠)；大肠杆菌BL21菌株、HEK293T及HUVEC细胞(北华大学医学技术学院实验室保存)；酵母提取物和胰蛋白胨、PMSF、NaCl、Tris-HCl、TEMED、IPTG、氨苄霉素、蛋白质分子量标准、考马斯亮蓝R-250(生工生物工程(上海)有限公司)；活/死细胞染色试剂盒(凯基生物技术有限公司).

1.2 RGD-ELPs与RDG-ELPs融合蛋白的原核表达

分别将pET-15b-RGD-ELPs、pET-15b-RDG-ELPs质粒转化为大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆接种到LB培养基中，37 ℃培养过夜；扩大培养，当OD600为 0.6～0.8时加入IPTG(终浓度为1 mmol/L)，25 ℃条件下继续培养7 h.离心收集菌体，PBS重悬菌体沉淀，通过超声波破碎仪裂解菌体，离心收集超声后的上清，SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况.

1.3 RGD-ELPs与RDG-ELPs融合蛋白的纯化

利用ITC方法快速纯化两种融合蛋白.ITC纯化操作：将超声后的上清用NaOH调节pH至9.0，4 ℃振荡过夜；4 ℃离心1 h，去除不溶性蛋白；分离上清，加入NaCl至终浓度为1 mol/L，37 ℃振荡3 h；37 ℃离心收集沉淀，加入PBS溶解沉淀.重复以上过程2～3个循环，将收集到的不同条件下的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析.

1.4 MTT检测

应用MTT法检测融合蛋白对HEK293T细胞增殖能力的影响.将HEK293T细胞以5 000个/孔细胞种于96孔板中，37 ℃培养24 h，然后分别加入终浓度为20、40、80、100、200 μg/mL 的 RGD-ELPs、RDG-ELPs融合蛋白，每个浓度分别设置5个重复孔；同时对照孔内加入DMEM培养基，培养48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育，4 h后弃去上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，溶解后应用酶标仪(TECAN M200)检测OD490值.

1.5 活/死细胞染色

将HEK293T细胞以5 000个/孔细胞种于96孔板中，37 ℃培养24 h；分别加入终浓度为200 μg/mL 的RGD-ELPs、RDG-ELPs融合蛋白，48 h后弃去培养基；加入100 μL/孔Calcein AM和Calcein PI混合染色液，室温染色30 min，应用荧光显微镜(Zeiss)成像技术成像.

1.6 细胞黏附表达方法

将终浓度为0、25、50、100、200、500 μg/mL的RGD-ELPs、RDG-ELPs融合蛋白包被小平底瓶，37 ℃孵育约2 h，4 ℃孵育过夜；弃去瓶中溶液，PBS洗3次后加入HUVEC细胞(2×104/孔)，37 ℃培养3 h；取出细胞悬液并计数，置于倒置显微镜下观察细胞黏附情况.细胞黏附率计算：黏附率=(总细胞数-悬液中细胞数)/总细胞数×100%.

2 结 果

2.1 RGD-ELPs融合蛋白的原核表达结果

将收集的菌体加入裂解液中，利用超声破碎后离心收集上清和沉淀.SDS-PAGE电泳分析结果显示：上清中，在分子量37 kDa左右出现明显的蛋白条带，与预计分子量相符；RGD-ELPs和RDG-ELPs主要以可溶性蛋白形式分布于上清液中，在沉淀中也有少量目的蛋白分布，这说明RGD-ELPs和RDG-ELPs两种融合蛋白在BL21大肠杆菌中以可溶性形式成功表达，为接下来的蛋白纯化创造了有利条件.见图1.

2.2 RGD-ELPs融合蛋白的纯化结果

通过ITC方法纯化RGD-ELPs和RDG-ELPs融合蛋白.在4 ℃条件下，因融合蛋白低于其相变温度(inverse temperature transition，Tt)，具有较高溶解度，分布于上清液中；当温度升高至37 ℃时，蛋白由于高于相变温度而发生相转变，以聚集体形式存在，目的蛋白从上清液中析出，通过离心收集沉淀复溶即可得到目的蛋白.纯化结果见图2.在预计分子量大小附近出现比较明显的蛋白条带，尽管在目的蛋白上方有少量杂蛋白条带，但目的蛋白仍然显示出较高的蛋白纯度.

2.3 细胞相容性分析

利用MTT法检测不同浓度的RGD-ELPs和RDG-ELPs融合蛋白对HEK293T细胞增殖能力的影响.结果见图3.加入蛋白后培养48 h，不同浓度的RGD-ELPs和RDG-ELPs融合蛋白处理组生长良好，在蛋白浓度为200 μg/mL时细胞存活率仍接近100%，说明两种蛋白具有良好的细胞相容性.活/死细胞染色也可用于评估材料与细胞的相容性，结果显示：与不加蛋白溶液的对照组比较，RGD-ELPs和RDG-ELPs处理组绝大多数为明亮的绿色细胞(活细胞)，细胞轮廓边界清晰，尽管视野中有少数红色细胞(死细胞)，推测可能是由于细胞汇合度过高而造成的，进一步提示两种融合蛋白具有良好相容性.

2.4 细胞黏附表达结果分析

有研究[10]显示：人工合成的RGD肽或者含有RGD序列的蛋白质均具有促进细胞黏附表达的效果.本研究结果显示：将细胞接种于RGD-ELPs和RDG-ELPs融合蛋白预包被的平底瓶中，培养3 h后对未贴壁细胞进行计数，计算黏附率.结果见图4.RDG-ELPs融合蛋白显示出微弱的黏附效果(小于10%)，RGD-ELPs蛋白黏附细胞的数量则随着蛋白浓度升高而逐渐增多，在浓度为100 μg/mL时黏附率超过60%，显示出剂量依赖的促黏附效果，表明RGD-ELPs具有较强的促进细胞黏附作用.

3 结 论

传统蛋白质通常通过亲和层析纯化重组蛋白进行纯化[11]，虽然它可用于实验室规模纯化，但是大规模生产的成本较高[12-13]，因此，需要更为经济且技术上更简单的方法来获得目的蛋白.由于ITC方法简单快速，成本低廉，且增加ITC循环次数可以提高目的蛋白纯度[14]，因此，近年来，利用融合ELPs蛋白的表达方法进行快速高效蛋白纯化得到广泛应用[15].

细胞与材料的黏附是组织工程研究的基础，是细胞在材料表面迁移、增殖和分化的前提[16].有研究[1]表明：在不添加外源黏合因子情况下细胞黏附效果并不理想，而RGD 肽作为整合素与其配体相互作用的识别位点，可介导细胞与细胞外基质的黏附作用[17].研究[18]显示：应用ELPs水凝胶包封人间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞，可为细胞提供类似天然的生长环境，检测到更强的细胞活力和更大范围的细胞扩散，该结果归因于水凝胶内部的RGD结构域，能为细胞提供黏附位点，进而影响细胞的生物学行为.因此，探索开发具有促细胞黏附功能的生物材料在组织工程研究领域具有重要意义.

综上所述，本研究成功表达纯化了RGD-ELPs和RDG-ELPs两种融合蛋白，两种蛋白均具有良好的细胞相容性，RGD-ELPs融合蛋白具有较强的细胞黏附作用，该研究结果可为组织工程研究筛选出适合细胞发挥生理功能的胞外基质材料，为将来应用于组织工程奠定基础.