厦门市水产品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染状况研究

◎ 翁琴云

（厦门市食品药品质量检验研究院，福建 厦门 361012）

副溶血性弧菌是近几年我国食源性疾病暴发的常见原因之一，人们常因食用被污染的生鲜、未充分煮熟或被交叉污染的水产品而引起副溶血性弧菌食物中毒。厦门是东南沿海重要的城市、港口及风景旅游城市，日常水产品消费比例较高[1]。根据已有的报道，由水产品中副溶血性弧菌引起的食物中毒事件占据了食物中毒事件的首位，已经成为厦门市主要的公共卫生问题之一，严重危害人们的身体健康并造成经济损失。而溶藻弧菌是一种人及水生动物共患的病原菌，不仅是养殖水产品的重要致病菌，爆发时可引起鱼、虾、贝类的大量死亡，给水产养殖业带来巨大的经济损失，而且对人也具有致病性，国内曾有多地报道溶藻弧菌引起的食物中毒事件[2-4]。本研究通过了解厦门市市售水产品副溶血性弧菌、溶藻弧菌污染及毒力基因分布情况，为预防食源性疾病，确保消费者健康，以及为监管部门制订防控措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从厦门市各个区的零售店、超市、农贸市场以及批发企业采集210批鲜活水产品，其中海水鱼72批，淡水48批以及90批贝类产品；3%碱性蛋白胨水、TCBS琼脂、3%氯化钠三糖铁琼脂（北京陆桥生物科技有限公司）；弧菌显色培养基（法国科玛嘉公司）；生化鉴定试剂盒VITEK GN鉴定卡、API 20E试剂盒（法国梅里埃公司）；副溶血性弧菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）、溶藻弧菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）、副溶血性弧菌（TDH、TRH、TLH）三重核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（深圳生科原生物有限公司）。

1.2 仪器与设备

GNP-9160隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；CFX96 Touch实时荧光PCR仪（美国伯乐公司）；VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定分析系统（法国梅里埃公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 检测依据依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》（GB 4789.7—2013）和美国食品和药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）发布的细菌分析学手册（Bacteriological Analytical Manual，BAM）第九章中弧菌的方法，进行前处理、增菌、分离及鉴定等检测工作。同时应用荧光PCR方法与VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定分析系统对可疑菌落进行鉴定。

1.3.2 副溶血性弧菌和溶藻弧菌的毒力基因分析

应用副溶血性弧菌（TDH、TRH、TLH）三重核酸检测试剂盒（荧光PCR法）进行副溶血性弧菌和溶藻弧菌的毒力基因分析。提取DNA以及荧光PCR均按照试剂盒的说明书进行。

1.3.3 统计学分析

应用SPSS 23对各种数据进行分析，组间差异用χ2检验，P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染状况

经过检测，在210批水产品中，除了11批样品（包括7批淡水鱼、3批淡水鱼和1批贝类水产品）未检出副溶血性弧菌及溶藻弧菌，其他199批（94.8%）样品中至少检出一种弧菌。其中，有148批（70.5%）样品同时检出副溶血性弧菌及溶藻弧菌。副溶血性弧菌和溶藻弧菌的检出率大致相当，分别是81.9%（172/210）和81.4%（171/210），如表1。

表1 副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情况表

2.2 不同类别食品污染情况

从食品类别来看，各种弧菌的检出率都是贝类水产品最高、海水鱼次之、淡水鱼最低。贝类产品、海水鱼、淡水鱼副溶血性弧菌检出率之间并不存在统计学差异；贝类水产品、海水鱼溶藻弧菌检测率均显著高于淡水鱼，存在统计学差异（χ2=4.63，P＜0.05及χ2=13.225，P＜0.05)，但海水鱼与贝类水产品检出率不存在统计学差异，见表2。

表2 不同类别样品的副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情况表

2.3 不同采样地点副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情况

不同的采样地点副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情况见表3。这2种弧菌在零售店、超市、农贸市场及批发企业中均有一定的检出率，其中批发企业的副溶血性弧菌和溶藻弧菌的检出率均高于其他采样点，分别是88.6%（39/44）、86.49%（38/44）。经过统计学分析，批发企业的副溶血性弧菌检出率显著高于零售店（χ2=4.962，P＜0.05），各个采样点的溶藻弧菌检出率不存在统计学差异。

表3 不同采样地点副溶血性弧菌和溶藻弧菌污染情况表

2.4 副溶血性弧菌及溶藻弧菌毒力基因分析

对分离得到的172株副溶血性弧菌以及171株溶藻弧菌进行毒力基因检测，结果表明172株副溶血性弧菌中均携带tlh基因，均未携带tdh基因，只有2份样品（草鱼及黑鱼）中分离得到的菌株携带trh基因，trh基因携带率为1.2%（2/172）；171株溶藻弧菌有9株溶藻弧菌菌株（包括5批贝类水产品、3批海水鱼及1批淡水鱼）携带tlh，所有菌株均未携带tdh、trh基因，基因携带率为5.3%（9/171），见表4。

表4 副溶血性弧菌及溶藻弧菌分离株毒力基因分析结果表

3 结论与讨论

通过对厦门市市售水产品中副溶血性弧菌及溶藻弧菌的检测分析，结果表明，副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染程度大致相同，检出率分别为81.9%及81.4%。其中，副溶血性弧菌的检出率与任淑敏等人[5]关于厦门市思明区的监测结果（81.11%）基本一致，但高于厦门市以往的监测结果。溶藻弧菌的检出率也与江苏省、北京市鲜活水产品的检测结果大致相仿。总体上这2种致病性弧菌的检出率比一些省市地区的监测结果高，分析原因，这与样品类别、采样时间有密切关系。温度是影响弧菌生长和分布的最主要因素。弧菌在低温条件下，容易处于活的非可培养状态，利用现有的常规培养方法不易检出，从而降低了弧菌检出率。而高温条件可明显促进弧菌生长，有研究表明海洋温度的升高可使弧菌丰度长期增加。本研究采样对象是鲜活水产品，样品没有经过低温保存环节，避免了低温对弧菌生长造成的影响，更能真实地反映水产品中的弧菌污染情况。而且本研究采集样品的时间正好是天气炎热的8月份，夏季高温季节更有利于弧菌的生长，造成了较高的检出率。

在不同的食品类别中，副溶血性弧菌及溶藻弧菌在贝类水产品的污染程度最高，检出率分别是84.4%（76/90）、90.0%（81/90），90批贝类水产品中仅有1批未检出副溶血性弧菌及溶藻弧菌。在以往的监测中也发现贝类水产品的弧菌检出率及污染水平高于其他类水产品。分析其原因，这与大多数贝类水产品的生活习性以及生理结构特点有关——贝类水产品属于滤食性生物，对滤食水体不具备选择性，相对于鱼类生物，贝类水产品栖息的场所比较固定，比较容易受到污染水体的影响。而且，加上贝类本身就具有较鱼类更高的富集有毒有害物质包括微生物的能力，经过进一步分析，本研究中的贝类水产品都是海水养殖的，被弧菌污染可能性更高。

分析不同采样地点的弧菌污染情况，结果显示批发企业的弧菌污染程度最高。这可能是因为样品的采集地点相对集中，44个样品集中在6个采样地点，在同一个采样地点的水产品因为储藏条件不当（比如温度过高）、销售环境复杂、卫生条件差等原因更容易造成弧菌在水产品中的交叉污染。

弧菌的致病性与毒力因子密切相关。大部分弧菌并非都是致病性弧菌，所以水产品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的高检出率并不能代表其真实的危害程度。需要进一步分析相关的毒力基因，以便更真实地进行风险评估。溶血素是一类非常重要的胞外产物，广泛分布在致病性弧菌中，在弧菌的致病过程中发挥着重要作用。副溶血弧菌的溶血素TDH、TRH和TLH是目前研究最多的溶血素，也是副溶血弧菌最重要的致病因子，与之相对应的毒力基因分别是毒力基因tdh、trh、tlh基因。有研究表明，临床分离或食物中毒食品的副溶血弧菌大多携带tdh基因及trh基因的一种或两种，而环境分离株中携带tdh或trh基因的概率很低，tlh基因在临床及环境分离株中均能检出。与已有的报道相似，本研究中从水产品中分离得到的172株副溶血性弧菌均检出tlh基因，均未检出tdh基因，只有2株菌株携带trh基因，这表明厦门市水产品中副溶血性弧菌tdh基因及trh基因携带率低，但2株含trh基因的副溶血性弧菌毒力株的存在，提示厦门市水产品中可能存在一定的食品安全风险。另外，由于副溶血弧菌和溶藻弧菌在基因组上的高度同源性，以及弧菌间毒力基因存在着水平转移现象，已有的研究表明在溶藻弧菌中也携带tdh、trh、tlh基因。本研究中从水产品中分离得到的171株溶藻弧菌菌株，只有9株携带tlh毒力基因，均不携带tdh、trh基因，与已有的报道结果一致。tlh基因广泛存在于副溶血性弧菌及溶藻弧菌中，但目前其功能尚不清楚，需要进一步的研究。