苏木乙酸乙酯提取物对慢性病毒性心肌炎小鼠心脏功能及心肌组织p38MAPK mRNA的影响

陈会君，李力恒，徐倩，张晶，刘志平，周亚滨*

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

慢性病毒性心肌炎的发病机制尚未完全阐明，主要包括病毒核酸在心肌中低水平持续复制而引起的直接心肌损伤以及由病毒激活并维持的免疫反应而导致的间接心肌损伤。其中免疫损伤、细胞凋亡、心肌纤维化等是慢性病毒性心肌炎的主要机制[1]。p38MAPK通道是诸多引起心肌纤维化的因素的共同通路[2-3]。

慢性病毒性心肌炎的治疗一直是困扰临床医生的难题，近年来，免疫抑制剂如肾上腺皮质激素、干扰素、FK506、环孢素、IL-6等的应用虽取得了一定的临床疗效，但同时也存在难以克服的局限性。由于免疫反应在慢性病毒性心肌炎的发病及演变过程中起重要作用，而课题组在前期的研究中证实了中药苏木具有明确的免疫抑制作用，并且确定乙酸乙酯提取物是其免疫抑制的有效部位，故本研究选用苏木乙酸乙酯提取物作为治疗药物，通过观察其对慢性病毒性心肌炎小鼠心脏功能、心肌组织p38MAPK mRNA的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

近交系纯种Balb/c健康雄性小鼠145只，SPF级，3～4周龄，体质量(10±2)g，由复旦大学上海医学院实验动物部提供，动物合格证号：SYXK(沪)2009-0082。鼠粮为清洁级小鼠生长繁殖颗粒饲料，每笼10只，层流架内分笼饲养于温度为20 ℃～24 ℃、湿度为50%～55%的屏障环境中。饲养符合《实验动物饲养和使用指南》相关规定。

1.1.2 实验病毒

柯萨奇B3病毒(CVB3)Nancy株，由复旦大学附属中山医院卫生部病毒性心脏病重点实验室馈赠。半数组织培养感染量(TCID50)为103.75,培养方法见参考文献[4]。

1.1.3 实验药物

1.1.3.1 苏木乙酸乙酯提取物

苏木原材，购于黑龙江省药材公司，产于云南省。苏木提取方法参见文献[5]。将苏木乙酸乙酯提取物溶于0.2%羧甲基纤维素钠溶液中，制备成浓度为70 mg/mL苏木乙酸乙酯提取物溶液。

1.1.3.2 环孢素软胶囊

规格为25 mg/粒，华北制药集团新药研究开发有限责任公司生产，国药准字H10960009，批号：20120501。将根据实验动物与人的体表面积比例系数换算，确定Balb/c小鼠每日服药剂量18.2 mg/kg。刺破胶囊，挤出油状药物，溶解到0.2%羧甲基纤维素钠溶解中，配制成浓度为3.0 mg/mL、2.0 mg/mL的溶液，室温保存备用。

1.1.3.4 羧甲基纤维素钠

将20 mg溶于10 mL蒸馏水中，配制成0.2%的羧基纤维素钠溶液，室温保存备用。

1.1.4 实验试剂

PCR引物：P38MARK 上游：5′-CGTTTGTGCCTATTGTTCTTGTT-3′，下游：5′-TGATCCATTGCTTTACCGTCTAC-3′；Beta Actin上游：5′-CCATTGAACACGGCATTG-3′，下游：5′-TACGACCAGAGGCATACA-3′。

1.1.5 主要仪器

Vevo 770超声诊断仪(加拿大VisualSonics公司)；6010可见-紫外分光光度计(美国安捷伦上海分析器厂)；转印电泳仪(北京六一仪器厂)；7500型定量PCR仪(美国应用生物系统公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型复制

雄性Balb/c小鼠145只，随机抽取10只作为空白对照组，其余135只小鼠用于模型复制。将TCID50为103.75的CVB3用MEM Eagle稀释至10-5，用1 mL注射器抽取,腹部推注病毒稀释液0.1 mL，第15天采用如上方法给每只小鼠注射病毒稀释液0.15 mL，第30天给每只小鼠注射病毒稀释液0.2 mL。空白对照组于相应时间点腹腔注射同体积的MEM Eagle液。于实验第15、30、45天各脊髓脱臼法处死2只模型小鼠，HE染色观察心肌病理组织，出现了典型的慢性心肌炎的病理变化，证实模型成功。第45天共计存活77只小鼠，随机抽取75只作为慢性病毒性心肌炎模型小鼠进行实验。

1.2.2 实验分组及给药

共分为4组,将10只腹腔射MEM Eagle液的小鼠作为空白对照组；将75只造模成功的病毒性心肌炎小鼠，随机分为3组，即模型对照组、环孢素组、苏木乙酸乙酯提取物组(简称苏木组)，每组25只。

空白对照组和模型对照组小鼠每天灌服羧甲基纤维素钠溶液0.2 mL。苏木组小鼠灌服700 mg/(kg·d)苏木乙酸乙酯提取物羧甲基纤维素钠溶液，每天灌胃量为0.2 mL。环孢素组小鼠灌服30 mg/(kg·d)环孢素羧甲基纤维素钠溶液，先灌胃10 d；然后改为20 mg/(kg·d)环孢素羧甲基纤维素钠溶液，灌胃10 d。每天灌胃量为0.2 mL。

以上溶液羧甲基纤维素钠的浓度均为0.2%。灌胃药物每天灌胃前随用随配。各组Balb/c小鼠均于实验第45天开始灌胃。每天灌胃1次，连续灌胃20 d。

1.2.3 标本采集

于实验第65天采用颈椎脱臼的方法处死全部存活的小鼠进行标本采集。给小鼠做常规固定、消毒、开胸，取出心脏后立即放入4 ℃预冷的生理盐水中，将残余血液冲洗干净，再用滤纸吸干，观察心脏外观，用电子天平称量心脏重量。然后沿左室长轴将心脏分成两份，一份用10%中性福尔马林溶液固定，用于HE、VG染色和免疫组化检查。一份液氮冷冻后放入-70 ℃低温冰箱冻存，用于PCR检测。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 小鼠一般状态

观察各组小鼠在实验过程中的精神、活动状态、饮食饮水、毛色形态变化等状况，并详细记录小鼠的死亡情况。

1.3.2 超声心动图检查

灌胃结束后，对各组小鼠进行心脏超声检查。

1.3.3 Real-Time PCR法观察心肌组织p38MAPK mRNA

灌胃结束后，取材心脏对各组小鼠心肌组织进行p38MAPK mRNA测定。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠的一般状态

空白对照组小鼠皮毛光泽，肌肉充实，正常饮食、活动，明显体重增加，无死亡。慢性病毒性心肌炎模型小鼠首次注射病毒第3天开始出现精神萎靡，饮食下降，消瘦，皮毛凌乱、毛糙无光泽，易激惹或对外界反应淡漠，第4天开始出现死亡，共计存活小鼠77只，随机取75只作为病毒性心肌炎模型小鼠进行灌胃。灌胃后，模型小鼠仍精神萎靡，饮食不佳饮，皮毛凌乱，消瘦。5 d后，苏木组小鼠的状态明显好于模型对照组和环孢素组。灌胃期间，模型对照组小鼠死亡7只，环孢素组死亡12只，苏木组死亡5只。

2.2 小鼠心脏超声检查结果

病毒感染后各组小鼠心腔都有不同程度扩大,心室壁活动度减弱,左室收缩末期与舒张末期内径不同程度增大，左心室功能减退。结果见图1。与空白对照组相比, 模型对照组小鼠LVEDD与LVESD显著扩大(P<0.01)；与模型对照组相比，环孢素组和苏木组的LVEDD和LVESD均明显减小(P<0.05)；苏木组与环孢素组比较无显著差异(P>0.05)。与空白对照组相比,模型对照组小鼠左室EF与FS值显著下降(P<0.01)；与模型对照组相比，环孢素组与苏木组小鼠的左室EF与FS值均明显增加(P<0.05)；苏木组与环孢素组比较无显著差异(P>0.05)。见表1、表2。

图1 各组小鼠心脏彩超情况

表1 各组小鼠左室舒张期末、收缩期末内径比较

表2 各组小鼠左室收缩功能比较

2.3 小鼠心肌组织p38MAPK mRNA表达

与空白对照组相比，模型对照组的p38MAPK mRNA表达明显增加(P<0.05)；与模型对照组相比，环孢素组、苏木组的p38MAPK mRNA表达均明显降低(P<0.05)；环孢素和苏木组的p38MAPK mRNA表达无明显差异(P>0.05)。结果见图2。

注：与空白对照组比较，▲P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

慢性病毒性心肌炎是西医学病名，根据其主要临床表现可将其归属于“心悸”“胸痹”范畴；在国家标准《中医临床诊疗术语》中称之为“心瘅”。本病病位在心，外感六淫是本病的主要致病因素，其中尤以风热、风温最为常见。病机主要为温热余邪留恋，伤及气阴，瘀血阻络。

苏木，性味甘、咸、辛、凉，归心、肝、脾、胃经，可活血散瘀、消肿止痛。《新修本草》云：“主破血，产后血胀闷欲死者。”《本草求真》中对苏木有“功用有类红花，少用则和血，多用则破血”的记载。古代医家多用于治疗跌打损伤，痛经，血滞经闭，产后瘀血腹痛，心腹疼痛，痈肿疮毒等。苏木是课题组上世纪90年代从众多活血化瘀药中筛选出的免疫抑制作用较为突出的中药材之一。

本实验中，病毒感染各组小鼠心腔都有不同程度扩大, 心室壁活动度减弱,左室收缩末期与舒张末期内径不同程度增大，左心室功能减退。其中模型对照组小鼠左室明显扩大，射血分数与缩短分数明显降低，说明病毒感染后小鼠心肌组织损伤严重，呈慢性病毒性心肌炎、心衰甚至向扩张型心肌病发展[6-7]。与模型对照组相比，环孢素组与苏木组左室舒张末与左室收缩末径都明显减少，射血分数和缩短分数却明显升高，表明苏木乙酸乙酯提取物和环孢素A均具有改善慢性病毒性心肌炎小鼠心功能的作用，二者比较无显著差异。结果表明，苏木乙酸乙酯提取物在改善病毒性心肌炎小鼠心功能方面疗效肯定，这可能与其活血祛瘀，消肿止痛，减轻小鼠心肌病理损伤，抑制心肌纤维化有关。

p38MAPK在多种心血管疾病的发生发展过程中起着十分重要的作用。p38MAPK与心室重构关系密切[8-9]，当心肌细胞受到刺激后产生炎症因子，活化p38MAPK通路，诱导心肌蛋白合成，心肌细胞肥大，进而发生心肌肥厚[10-11]。本实验中，与空白对照组相比，模型对照组的p38MAPK mRNA表达明显增加，表明病毒感染后，p38MAPK通道受到病毒刺激而被活化，被活化的p38MAPK加速CVB3的复制，加重炎症反应，促进心肌细胞凋亡和成纤维细胞活化，并诱导细胞外基质胶原增生，而出现心肌纤维化的病理损伤，导致心肌肥厚，心室重构，心脏功能受损，严重者出现心衰的表现，超声检查中亦可见心功能减退。而苏木组的p38MAPK mRNA表达明显降低，表明苏木乙酸乙酯提取物可以抑制p38MAPK活化，切断p38MAPK通道，抑制病毒的持续复制，减少细胞凋亡，抑制成纤维细胞表型发生转变，减弱其分泌细胞外基质的能力，从而最终减轻或抑制心肌纤维化，改善心功能。

本研究证实苏木乙酸乙酯提取物能够改善慢性病毒性心肌炎小鼠心肌的心脏功能，抑制心脏肥大；苏木乙酸乙酯提取物能够抑制慢性病毒性心肌炎小鼠心肌组织p38MAPK mRNA的表达，这可能是其治疗慢性病毒性心肌炎的机制之一。