基于网络药理学牛膝对成骨细胞影响的潜在分子机制研究

张佳旭，郭新月，李晓亮，林晓婷，李嘉楠，杨柳

(黑龙江中医药大学北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身性骨代谢性疾病,以骨量丢失和骨组织微观结构的损伤为特点[1]。目前公认的OP发病机制之一是破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞(osteoblast，OB)介导的骨形成之间的动态平衡被打破,导致骨吸收大于骨形成,骨量下降[2]。现阶段，在治疗OP的药物中，促进骨形成的药物只有甲状旁腺激素是被美国食品药物管理局唯一批准的[3]。但是甲状旁腺激素由于可能会导致骨肉瘤,这使甲状旁腺激素的临床使用受到了限制[4]。OB主要由内外骨膜和骨髓中基质内的间充质始祖细胞分化而来，能特异性分泌多种生物活性物质，调节并影响骨的形成和重建过程[5]。OB参与了骨基质成分如Ⅰ型胶原的产生，在骨质代谢调节中起着关键作用[6],此外还具有影响钙离子和磷酸盐在骨化中心浓聚并诱导骨基质成分矿化的功能，以及会产生与体内基质矿化有关的骨钙蛋白、骨桥蛋白和骨唾液酸糖蛋白[7]。因此OB的生长、分化和活性的改变在一些骨科发病机制中起着重要作用。

牛膝，为苋科植物牛膝(RAB)的干燥根。冬季茎叶枯萎时采挖，除去须根和泥沙，捆成小把，晒至于皱后，将顶端切齐，晒干。分布于全国，在有些地区有大量栽培品种[8]。具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行的功能。用于经闭、痛经、腰膝酸痛、筋骨无力等。《名医别录》中记载RAB“疗伤中少气，男子阴消，老人失溺，补中续绝，益精利阴气，填骨髓，止发白，除脑中痛及腰脊痛，妇人月水不通，血结。”RAB是补肝肾、强筋骨之要药，既往研究也表明RAB具有抗骨质疏松的作用，RAB当中的甾体对于OB的增殖与分化也有很大的影响，但是RAB对OB影响的潜在在分子机制仍然有待于具体研究[9]。

网络药理学是近年来新兴的一门学科，它基于前沿的科学研究成果和文献资料，以“疾病-基因-靶标-药物”概念为基础，以系统、综合的观点看待药物对疾病网络的干预和作用，从而揭示药物对人体的复杂的作用机制[10-11]。这与中药多成分、多途径、多靶点协同作用的机制是高度统一的[12]。因此，本文借助网络药理学的方法，探讨RAB对于OB影响的潜在可能机制，为今后的RAB现代药理研究以及骨科疾病的靶向药物研究提供一定的参考依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

数据库：TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、UniProt(https://www.uniprot.org)、Gene Cards(https://www.genecards.org/)、Dig See(https://omictools.com/digsee-tool)、OMIM(https://www.omim.org)、String(https://string-db.org/cgi/input.pl)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)。

软件：在线Venn图绘制工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)、Cytoscape、R、RStudio。

1.2 方法

1.2.1 活性成分的筛选与活性成分靶点的预测

利用TCMSP数据库检索RAB当中的化学成分，筛选出口服利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%，药物相似性(Drug-likeness,DL)≥0.18的化学成分作为RAB的主要活性成分。结合文献查阅结果，整理添加符合要求的化合物。对其候选化合物名称进行检索并整理对应的靶蛋白。将整理好的靶蛋白导入到UniProt数据库，选择物种为“Homo Sapiens”，获取每个靶蛋白所对应的靶基因，最后将得到的靶基因进行合并，保留唯一项，所得结果即为RAB活性成分的靶点。

1.2.2 拓扑网络的构建

以“osteoblast”为关键词在Gene Cards、Dig See以及 OMIM数据库中查找与成骨蛋白相关的靶点，合并3个数据库的检索结果。将上述得到的靶点和检索结果经过在线Venn图绘制工具映射获得RAB影响OB的潜在作用靶点。建立活性成分-作用靶点相互作用数据库，并导入到Cytoscape软件中，构建RAB影响OB蛋白拓扑网络图。

1.2.3 RAB影响OB关键靶点分析

为了进一步研究RAB影响OB的可能作用机制，将RAB的作用靶点导入到 String数据库中,限定研究物种为“Homo Sapiens”, 选择可信度最小值为0.900，获得蛋白互作关系，将所得数据文件导入到Cytoscape中，构建蛋白互做网络图，得到RAB影响OB的关键靶点。

1.2.4 基因富集分析

利用DAVID数据库对潜在靶点进行GO(Gene ontology)功能富集分析，研究RAB影响OB的主要生物功能；对潜在的靶点进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，研究RAB影响OB主要信号通路。将获得的富集结果利用R语言对主要生物功能进行可视化分析。

2 结果

2.1 活性成分的筛选与活性成分靶点的预测

结合文献和数据库的检索结果，得出符合条件的化学成分主要包括β-蜕皮甾酮(β-ecdysterone)、牛膝苷(bidentatoside)、刺苷A(Spinoside A)、小檗碱(berberine)和汉黄芩素(wogonin)等20个化学成分。之后利用TCMSP进行靶标预测并筛选，得到RAB活性成分靶点主要包括前列腺素G/H合酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、核受体辅激活剂2(Nuclear receptor coactivator 2，NCOA2)、激素受体(Androgen receptor，AR)、孕激素受体(Progesterone receptor，PGR)和5亚基钠通道蛋白(Sodium channel protein type 5 subunit alpha，SCN5A)等254个。

2.2 拓扑网络的构建

在Gene Cards等数据库得到OB的相关基因92 370个，经在线Venn图处理得到RAB靶点与影响OB的靶点的共有基因204个，即为RAB影响OB的潜在作用靶点。Venn图见图1。将虚拟选出的候选化合物和靶点预测得到的靶点基因输入Cytoscape软件构建药物-活性成分-作用靶点-细胞网络，得到图2。根据网络拓扑学原理根据度值由大到小对筛选出的化合物进行分析，详细的信息见表1。

图1 潜在作用靶点Venn图

注：该网络包括220个节点，602条边，其中204个节点为RAB作用于OB的靶点，网络中表示为黄色，14个节点为RAB作用于OB有直接作用关系的活性成分，在网络中表示为蓝色，红色菱形表示为药物和疾病。

表1 RAB影响OB的主要化合物

2.3 RAB影响OB的关键靶点

将上面所得的204个潜在可能靶点上传至String数据库，将上述条件删选之后得到结果导入Cytoscape构建蛋白互作网络图，见图3。由于潜在靶点数目过多，根据度值大小选择度值大于10的前52个靶点进行分析，得到RAB影响OB关键蛋白互作网络图，见图4。其中转录因子AP(JUN)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、肿瘤蛋白p53(TP53)、转录因子p65(RELA)、肿瘤坏死因子(TNF)、RAC-alpha serine/threonine-protein kinase(AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、原癌基因c-Fos(FOS)和原癌基因蛋白(MYC)是排名前10的关键靶点。度值越大表明蛋白质在蛋白互作网络中的影响程度越大，参与的生物功能越多，这也可能是RAB影响OB的关键靶点。

注：该网络包括159个节点，692条边，圆圈由大变小，颜色由深变浅，度值相应由大变小，边的粗细表示连接评分，链接评分越高，边越粗。

注：该网络包括52个节点，318条边，圆圈由大变小，颜色由深变浅，度值相应由大变小，边的粗细表示连接评分，链接评分越高，边越粗。

2.4 基因富集分析结果

将上述潜在靶蛋白上传至DAVID数据库并进行GO注释及KEGG信号通路的富集分析。其中得到生物过程(Biology Process，BP)条目616个，根据P值大小排名前10的分别是DNA模板转录(transcription,DNA-templated)、信号传导(signal transduction)、药物反应(response to drug)、DNA模板化转录正调控(positive regulation of transcription,DNA-templated)、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、基因表达的正调控(positive regulation of gene expression)、细胞增殖的正调控(positive regulation of cell proliferation)、凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)、炎症反应(inflammatory response)和凋亡过程(apoptotic process)。细胞组成(cellular component，CC)条目71个，根据P值大小排名前10的分别是质膜(plasma membrane)、细胞核(nucleus)、核质(nucleoplasm)、线粒体(mitochondrion)、膜(membrane)、细胞外空隙(extracellular space)、胞外区(extracellular region)、胞外体(extracellular exosome)、胞液(cytosol)和细胞质(cytoplasm)。分子功能(Molecular Function，MF)条目分别为130个，根据P值大小排名前10的分别是锌离子结合(zinc ion binding)、序列特异性DNA结合转录因子活性(transcription factor activity, sequence-specific DNA binding)、序列特异性DNA结合蛋白(sequence-specific DNA binding)、蛋白质同源二聚化活性(protein homodimerization activity)、蛋白质异构化活性(protein heterodimerization activity)、蛋白质结合(protein binding)、同蛋白结合(identical protein binding)、酶结合(enzyme binding)、DNA结合(DNA binding)和ATP结合(ATP binding)。KEGG通路分析得到129个代谢通路，根据P值大小排名前10的分别是肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、癌症中的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌症的通路(Pathways in cancer)、小分子核糖核酸在癌症通路(MicroRNAs in cancer)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、甲型流感(Influenza A)、HTLV-Ⅰ感染(HTLV-Ⅰ infection)乙型肝炎(Hepatitis B)等通路。每个模块的前10位条目见图5，KEGG通路的详细信息见表2。

表2 KEGG通路分析结果

注：图A表示BP功能富集分析结果，图B 表示CC功能富集分析结果，图C表示MF功能富集分析结果，图D KEGG通路分析结果。其中气泡的大小代表与OB相关性以及涉及到该通路的基因数，颜色代表的富集显著性。

2.5 构建网络拓扑图

整合RAB化学成分-靶点网络、关键靶点PPI网络以及上述可能参与到影响OB调节过程的前10条KEGG信号通路等信息，利用Cytoscape软件构建“化学成分-OB-KEGG 信号通路”多维网络，见图6。

注:该网络包括72个节点，308条边，其中红色菱形表示RAB当中主要化学成分，黄色倒三角表示KEGG通路信息，绿色圆圈表示影响OB关键靶点。

3 讨论

OP是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病,在老年人群中的发病率较高[13]。OB由于其特性，被认为是治疗OP的一个突破口。本文应用网络药理学方法对RAB影响OB的作用机制进行初步研究，构建了RAB化学成分-OB-KEGG 信号通路网络，系统性揭示了RAB影响OB的物质基础和分子机制。其中槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、β-谷甾醇、黄芩素5个化合物在网络中的度值较大，可能是影响OB的关键化合物。但是不容忽视的是槲皮素、山柰酚两种化合物在中草药中分布较广，这可能不是RAB具有强筋骨特性的关键物质。并且由于目前对于RAB当中的β-蜕皮甾酮的研究比较少，所以导致其靶蛋白靶基因的数据相对较少，因而在网络中没有显示出来。并且，姜涛等人通过细胞实验发现对β-蜕皮甾酮能够显著促进OB的增殖以及分化，牛膝甾酮能够通过上调OB分化相关基因及刺激自噬体的形成而促进其的分化[14-15]。这说明β-蜕皮甾酮和牛膝甾酮也可能是RAB治疗OP的主要活性成分之一。

MAPK是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者[16]。细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)-MAPK是连接细胞表面和细胞核以控制细胞增殖和分化的重要途径[17]。既往研究显示MAPK对OB的增殖、凋亡及分化有着重要的作用[18-21]。MAPK的激活被证明可以刺激跨基因动物OB的分化，并在不影响细胞增殖的情况下加速发育胚胎的骨积累[22]。相反，主导阴性MAPK抑制会减缓细胞培养中OB的分化，延缓骨发育[23]。在本研究中，RAB可能通过MAPK的三种亚型MAPK1、MAPK8、MAPK14来达到调节OB增值分化的目的，并且这一影响很可能是通过MAPK信号通路实现的。MAPK信号通路是经典信号通路之一，有三级的信号传递过程：MAPK、MAPK激酶(MEK或MKK)以及MAPK激酶的激酶(MEKK或MKKK)。这三种激酶能依次激活，共同调节着细胞的生长、分化、应激、炎症反应等多种重要的生理、病理效应[24]。大量的研究证明，MAPK信号通路对于OB和破骨细胞的平衡有很大的影响[25]。

TNF是由活化的单核巨噬细胞产生，对肿瘤细胞具有杀伤和抑制作用，同时还有抗感染的作用[26]。TNF细胞被认为是p38的诱导性因子，与MSCs和MC3T3中IL6的合成有关[27]。研究表明TNF小鼠通过p38抑制BMP2成骨[28]。化学抑制p38可恢复由BMP-2触发的RUNX2和其他成骨标志物的表达水平[28]。TNF介导的p38激活也与Rankl的早期表达有关，但与晚期表达无关[29]。宋献美等人研究表明RAB通过逆转 TH17/Treg的失衡、可以抑制TNF的分泌[30]。因而RAB可能通过抑制TNF的分泌来影响p38从而改变OB的增值分化，这可能是RAB影响OB的分子机制之一。肿瘤坏死因子信号通路在这当中的作用也有待于被挖掘。

综上所述，RAB影响OB具有多成分-多靶点-多途径的特点，其主要通路不仅直接参与骨细胞的增殖、分化及凋亡，调节成骨、破骨代谢平衡，还通过调节免疫、炎症、自噬等干预OB的功能，影响骨微环境。但本研究只是在分子机制上进行的预测探讨，具体药物作用机制仍需进一步实验验证。