五倍子、儿茶和黄连对130株艰难梭菌的体外抗菌活性研究

赵峰，杨靖，李志荣，强翠欣，李茹鑫，赵杏珍，王晓明，赵宝鑫，翟宇，李仲兴，赵建宏*

(1.石家庄市第一医院，河北 石家庄 050000; 2.河北医科大学第二医院,省临床检验中心，河北 石家庄 050000；3.河北省中医院，河北 石家庄 050000)

艰难梭菌(Clostridiumdifficile，CD)是一种革兰阳性专性厌氧芽孢杆菌。艰难梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)引起的症状轻重不一，轻者仅有轻度腹泻，严重者可引起死亡。2013年和2019年美国疾病控制与预防中心(CDC)将其列为几种导致公共健康威胁的微生物之一，耐药威胁等级为最高的“紧急”级别。近年来，艰难梭菌高产毒株(027/NAPl/BI)在美国、加拿大、欧洲许多地区出现感染暴发情况以及流行传播，病死率及复发率高[1-3]，在全世界范围内已引起广泛的关注。中草药在我国具有上千年的使用历史，在目前耐药菌株大量产生的背景下，我国传统中草药却没有出现显著的耐药情况，这可能是由于中药独特的抗菌(增效)机制[4]。目前，甲硝唑与万古霉素是治疗CDI的首选药物[5]。但CD对甲硝唑耐药率在逐步增高，且已发现了对甲硝唑耐药和对万古霉素敏感性下降的菌株[6]。有研究表明CDI患者在接受万古霉素、甲硝唑治疗30 d以内的复发率高达15%～35%，复发的患者比初次感染患者治疗难度大[7]。此外，Nathwani等研究发现，万古霉素治疗过程中可使人体正常专性厌氧菌在整个肠道菌群所占比例减少，兼性厌氧菌和微需氧菌群所占比例增多[8]。这对临床治疗CDI造成了困难，因此发现和研制治疗CDI的新药势在必行。

本实验选取了具有收敛固涩作用的五倍子、收湿敛疮功效的儿茶和清热燥湿作用的黄连3味中药，研究其对CD的体外抗菌活性，为中药治疗CDI提供依据。

1 实验材料

1.1 仪器

微量多点接种仪(日本佐久间制作所)；比浊仪(France BioMerieux公司)；生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)；超低温冰箱(China Haier公司)；精密分析天平(Japan A&D公司)；全自动高压蒸汽灭菌仪(Japan ALP公司)；厌氧培养系统(广州尤德公司)。

1.2 试剂

布鲁氏琼脂(Becton,Dickinson and Company)；布鲁氏肉汤(Becton,Dickinson and Company)；氯化血红素(西安拉维亚生物科技有限公司)；维生素K1(辰欣药业股份有限公司)；氢氧化钠(天津市大陆化学试剂厂)；脱纤维羊血(北京陆桥科技有限公司)。

1.3 药材与产地

五倍子(河北)、儿茶(云南)、黄连(四川)均购自石家庄市中医院,经由药师张占鉴定,符合2015版《中国药典》规定，为正品。

1.4 菌种

本实验所用的130株CD均来自河北省医学微生物菌种保存中心(Hebei provincial centre for medical culture collection, HBCMCC)。

2 方法

2.1 中药水煎剂制备

五倍子和黄连煎液制备以五倍子为例:称取五倍子50 g,加水适量浸泡35～45 min,一煎30 min,收集煎液,再将药渣加适量水二煎20 min,两煎共收集煎液100 mL并过滤，此为50%(1∶2)五倍子水煎液，过滤液无菌储存备用。

儿茶煎液制备:称取儿茶50 g，切成约0.5 cm×0.5 cm大小。加适量清水浸泡30～40 min，先用武火煮沸，然后改用文火使其保持沸腾，一煎30 min, 收集上清煎液, 再将药渣加适量水二煎20 min, 两煎共收集煎液100 mL并过滤。此为50%(1∶2)儿茶水煎液，过滤液无菌储存备用。

2.2 中药琼脂平板制备

取10只无菌试管并标记为1～10号，在第1号管中加入50%(1∶2)水煎液2 mL，2～9号管做水煎液的倍比稀释。取2 mL无菌蒸馏水分别加入2～9号管中。在2号管加入50%(1∶2)中药过滤水煎液2 mL，混匀后取出2 mL加到第3号管，混匀，取出2 mL加入到第4号管，依次方法直到第9号管。这样1～9号管为2 mL的倍比稀释液，第10号管加入2 mL无菌蒸馏水做对照。取无菌培养基瓶10只，每瓶加入溶化的无菌布鲁氏琼脂18 mL，将第1～9号管的中药倍比稀释和10号管的对照液分别倒入10只培养基瓶中，混匀后依次倒入1～10号培养皿平板。1～9号平板为20 mL含药琼脂培养皿，10号平板为对照，凝固后备用。第1号的琼脂平板实际含中药1∶20(5%),第2号1∶40(2.5%),第3号1∶80(1.25%),第4号1∶160(0.625%)……。

2.3 MIC测定

取CD菌落，配制成0.5麦氏浊度的菌悬液，然后将CD菌悬液接种到含药培养皿琼脂平板和对照板上，无菌烤箱烘干，置于厌氧罐中，37 ℃培养48 h。观察CD生长情况，记录MIC值。

2.4 含中药培养皿的药物浓度计算

将熬制的100 mL煎液用滤纸过滤。取20 mL滤液放于50 ℃无菌烤箱中烘干，得出干重量。干重量除以20就是1 mL滤液的中药含量，再除以琼脂的稀释倍数可得出1 mL琼脂中含中药的药量。例如20 mL儿茶水煎液(1∶2)干重为4 484.6 mg，在第1号儿茶培养皿中，含布鲁氏琼脂18 mL和煎液2 mL(1∶2)，则培养基儿茶中药浓度为22.423 mg/mL。

3 结果

3.1 五倍子、儿茶和黄连对130株CD的抗菌活性

本实验研究了五倍子、儿茶和黄连3味中药对130株CD的体外抗菌活性。其中以五倍子对CD的体外抗菌活性最强，其次是儿茶，最弱的是黄连，3味中药对CD的抗菌活性见表1。

表1 五倍子、儿茶和黄连对130株CD的抗菌活性(mg/mL)

3.2 五倍子等3种中药对130株CD的累积抑菌率

本实验采用琼脂稀释法研究五倍子、儿茶和黄连3味中药对CD的抗菌活性，随着试验药物稀释倍数的增加，3味中药的抑制菌株数和累积抑菌率逐渐下降，见表2。

表2 五倍子等3种中药对130株CD的累积抑菌率

随着五倍子药物浓度的增加，其对CD的累积抑菌率也在增加，当五倍子浓度为0.250 mg/mL时，累积抑菌率达100%。五倍子对CD的累积抑菌百分率见图1。

图1 五倍子对130株CD的累积抑菌百分率(%)

儿茶浓度为22.423 mg/mL时，累积抑菌率达100%。儿茶对130株CD的累积抑菌百分率见图2。

图2 儿茶对130株CD的累积抑菌百分率(%)

本实验结果发现，黄连只对12株(9.2%)CD有抑菌作用，对另外118株CD无抗菌作用。黄连的累积抑菌百分率见图3。

图3 黄连对130株CD的累积抑菌百分率(%)

4 讨论

本实验以水煎液为研究对象，与中药剂型中的“汤剂”一致。中药汤剂在我国已有千年的历史。《针灸甲乙经》序言有“汤液始于伊尹”之说，说明汤剂在商代就已出现。五倍子作为传统中药，在《开宝本草》就有记载，具有涩肠固精、收湿敛汗等多种临床功效[9]。化学成分以五倍子鞣质为主，鞣质是一种复杂的酚类化合物，结构比较复杂，是倍酰葡萄糖的化合物，即葡萄糖上的醇羟基与没食子酸上的羟基所形成的酯类化合物。β-五-间双没食子酰葡萄糖的特殊化学结构赋予了五倍子鞣质特有的抗菌活性[10]。五倍子对细菌、真菌有很强抑菌作用[11-12]。李仲兴等发现五倍子对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌有抑菌效果[13-14]。并发现五倍子对表皮葡萄球菌的抗菌作用是干扰细胞壁合成的同时损伤细胞膜，使细菌溶解，破裂死亡。五倍子对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有较强体外抗菌活性，其抗菌作用强于黄连和黄芩[15]。本实验中五倍子对130株CD的MIC90为0.225 mg/mL，也就是说，当五倍子水煎液的药物浓度达到0.225 mg/mL时，就可以抑制130株中90%的CD菌株。但五倍子对CD的抑菌作用具体机制不详，是否是鞣质对CD单独有抗菌作用，还是和其他成分共同发挥抑菌作用这还有待于进一步的研究。其他五倍子剂型是否与汤剂一样具有体外CD抗菌作用也有待于研究。此外，我国五倍子分布在十余个省份，药材除应选取道地药材外，还应注意药材的产地。不同省份的五倍子药材对细菌体外抑菌效果有差异。有研究发现河北、浙江、陕西、云南、湖南所产五倍子体外抑菌效果较强，其中云南产五倍子鞣质对金葡菌、大肠杆菌、绿脓杆菌体外抑菌效果明显，陕西、浙江产五倍子鞣质对白色念株菌的有较强体外抑菌效果[16]。本研究中所用的五倍子产地为河北，不同省份的五倍子对CD的抑制作用如何还需进一步研究比较。

儿茶是一种常用的中药材，广泛种植于气候湿润地区,具有收湿敛疮、止血等功效。本实验中儿茶对CD有体外抗菌活性，其MIC范围是4.128～ 22.423 mg/mL。儿茶的MIC范围较大，最大值和最小值相差约6倍。对其原因进行分析，发现其MIC值为4.128 mg/mL的菌株仅1株，PCR核糖体型别为HB24。MIC值为22.423 mg/mL的菌株也仅1株，其PCR核糖体型别为HB9。其他型别的MIC为8.100 1～16.200 3 mg/mL。由此推测儿茶的MIC值与艰难梭菌的PCR核糖体分型有关。但本实验的艰难梭菌样本数仅130株，因此需要增加样本量来进一步确认它们之间的关系。儿茶中含有黄酮和酚酸类成分。研究发现儿茶水煎液对金葡菌、表皮葡萄球菌、肠球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌有体外抑制作用[17]，但其对细菌的具体作用机制有待于进一步研究。

本实验中黄连只对12株CD有抗菌活性，对另外118株CD无抑制作用，抑菌率为9.2%。这可能是由于黄连水煎液药物浓度较低，没有达到有效的抗菌作用浓度。其次可能是黄连本身对CD抗菌能力弱。本实验的黄连产地为四川，不同的产地，气候条件、温湿度变化等因素均可能影响药效。

本研究发现五倍子、儿茶和黄连对CD均有抑制作用。五倍子对CD的抗菌活性最强，其次是儿茶，最后是黄连。但这仅是体外实验结果，至于体内作用如何，尚需进一步的研究。我国地跨温带和亚热带，适宜中药材的生长。研究中药方剂对CD的抗菌作用，可以为临床采用中药治疗CDI提供新的治疗途径和思路。