阿托伐他汀对急性心肌梗死动物模型Nrf2/HO-1途径的影响

王志利，刘锋，赵晓燕

急性心肌梗死（AMI）是引起人类死亡的主要原因之一，心肌组织的血液灌注受阻会使氧自由基等活性氧物质产生增加，诱导血管内皮细胞或心肌细胞的炎性细胞因子、趋化因子表达，造成心肌损伤[1,2]。Nrf2/HO-1通路是调节氧化应激的关键通路，其激活降低氧化应激和炎性因子水平，并保护血管内皮细胞和心肌细胞，Nrf2/HO-1通路在AMI心肌细胞损伤和凋亡中起到重要作用[3]。阿托伐他汀（ATV）是调脂药物，在治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）中被广泛应用，近年来研究发现，ATV具有保护AMI引起的心肌细胞损伤、抑制心室重构的作用[4]，但ATV在AMI中的作用和机制还需深入探究。最新研究显示ATV具有调节Nrf2通路的作用[5]，本文主要分析ATV对AMI大鼠模型的作用以及对Nrf2/HO-1途径的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料SD大鼠（SPF级，雄性，220～250 g，上海斯莱克实验动物中心，中国）。ATV（辉瑞，H20051407）。小动物呼吸机（Inspira ASV，哈佛仪器公司，美国）。BL-420 F小动物生物功能实验系统（成都泰盟科技有限公司，中国）。Mayer's苏木精和0.5%曙红水溶液（H8070，DH0050，北京Solarbio公司，中国）。酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒、TUNEL凋亡试剂盒（碧云天公司，中国）。酶标仪（Model 680，Bio-Rad，美国）。组织匀浆机（Thermo Fisher Scientific公司，美国）。RIPA裂解缓冲液（中国，北京，Beyotime）。BCA试剂盒（武汉博斯特生物技术有限公司，中国）。抗体购自美国Abcam公司。PVDF膜（Bio-Rad公司，美国）。显微镜（Olympus 公司，日本）。

1.2 方法30只大鼠随机分为Sham组、AMI组和AMI+ATV组3组，每组各10只。AMI组和AMI+ATV组大鼠按照参考文献进行结扎建立AMI模型[6]，腹腔注射1%戊巴比妥（3 ml/kg）麻醉大鼠，将针电极皮下插入四肢，并使用心电图通过四肢导线进行监测。在第3～4肋间隙开胸手术后，将大鼠插管并连接呼吸机（潮气量：3 ml/kg，呼吸频率：60～70 次/min）。将浅、深筋膜依次切开，暴露左胸腔打开心包，用6/0线结扎左前降支，此时大鼠ECG发生改变，心脏表面立即呈现深红色，心电图ST段抬高。保持结扎30 min，取出丝线行再灌注后缝合胸腔。为防止感染，大鼠在术后肌注青霉素80万单位。Sham组大鼠进行相同操作但不结扎。建模24 h后，AMI+ATV组大鼠使用ATV灌胃，剂量为10 mg/kg，1/d，连续7 d，Sham组和AMI组使用等量溶剂灌胃作为对照。

1.3 观察指标

1.3.1 心功能指标通过BL-420F生物功能实验系统检测心功能，该系统的2个通道用于检测左室收缩末期压力（LVESP）和左室舒张末期压力（LVEDP），通过4通道显示2通道心室收缩期间左心室压力的最大上升和下降速率（±dP/dt max）。

1.3.2 HE染色和心肌梗死面积的测量大鼠处死后取出心脏，沿结扎线分为两半，以保留结扎线和心尖之间的区域。将组织用4%的聚甲醛固定并用梯度醇脱水，包埋于石蜡中，制成厚度为5 μm的组织玻片标本。用Mayer's苏木精在室温下染色10 min，用0.5%曙红水溶液室温下染色3 min。根据HE染色结果，测定心肌组织左心室壁厚度（LVWT），室间隔厚度（IVST），内外膜弧长和疤痕内外周长，使用Image Pro Plus 6.0软件计算心肌梗死面积。梗死面积=（内膜的弧长+外膜的弧长）/（疤痕的内周+疤痕的外周）×100%。

1.3.3 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡取1.3.2的大鼠心脏乳头肌的石蜡切片进行实验，经常规脱蜡、抗原修复处理，用密封液封闭。将切片在37°C混合工作溶液（20 μg/ml蛋白酶K溶液，PH=7.5～8）中，孵育并修复15 min。加入50 μl的TUNEL反应溶液，在37°C下孵育1 h，使用PBST洗涤切片。加入100 μL的二氨基联苯胺在37℃下孵育30 min，PBST洗涤。最后，在显微镜下观察样品。随机选择每个组织的四个视野进行计算，并收集平均值。凋亡指数=凋亡核数/（凋亡核数+正常细胞核数）×100%。

1.3.4 ELISA大鼠麻醉后处死，然后采集血液样本，离心2000 rpm，20 min收集上层血清。使用ELISA试剂盒检测白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）按照说明书加入抗体，经酶标仪检测吸光度，根据标准曲线计算浓度。

1.3.5 Western blot从梗塞边界区获得心肌组织，用组织匀浆机均匀研磨。蛋白浓度通过双BCA试剂盒测量，分别取总量为40 μg的总蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（PAGE），（80～120 V，90 min）。在100 mV的恒定电压下与PVDF膜进行湿转移，在5%牛血清白蛋白（BSA）中于室温孵育1 h。将1：500稀释的anti-Nrf2、anti-HO-1添加到分离的蛋白质中，在4℃下孵育过夜。洗涤后在室温下添加二抗孵育1 h后，加入化学发光试剂进行显影。GAPDH用作内部参考，用Image J软件分析目标条带的灰度值。

1.4 统计学处理所有实验设立3个复孔作为平行实验。数据以平均值±标准偏差（SD）表示。统计分析使用SPSS 19.0软件。三组间比较用单因素方差分析，两两比较使用LSD-t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ATV对AMI组大鼠心功能的影响AMI组大鼠的LVESP、±dP/dt max显著低于Sham组而LVEDP显著高于Sham组（P＜0.05），AMI+ATV组大鼠的LVESP、±dP/dt max显著高于AMI组而LVEDP显著低于AMI组（P＜0.05），表1。

2.2 ATV对AMI组大鼠心肌梗死面积的影响Sham组大鼠无心肌梗死，AMI组大鼠的心肌梗死面积为（2.34±0.46）mm，（P＜0.05），AMI+ATV组大鼠的心肌梗死面积为（1.76±0.43）mm，显著低于AMI组（P＜0.05），图1。

2.3 ATV对AMI组大鼠心肌细胞凋亡的影响Sham组大鼠的凋亡指数为（1.14±0.20），AMI组的凋亡指数（13.62±2.48）显著高于Sham组（P＜0.05），AMI+ATV组的凋亡指数（6.78±1.74）显著低于AMI组（P＜0.05），图2。

2.4 ATV对AMI组大鼠血清炎性因子和氧化应激因子的影响AMI组大鼠的IL-6（17.32±3.21 pg/ml）、TNF-α（16.04±2.74 pg/ml）、MDA（14.38±2.04 nmol/ml）显著高于Sham组，SOD（57.32±11.78 U/ml）显著低于对照组（P＜0.05）。AMI+ATV组的IL-6（10.84±2.56 pg/ml）、TNF-α（8.42±1.78 pg/ml）、MDA（10.94±1.89 nmol/ml）显著低于AMI组，SOD（79.82±13.42 U/ml）显著高于AMI组（P＜0.05），表2。

表1 ATV对AMI大鼠心功能的影响

图1 HE染色检测心肌梗死面积

图2 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况

2.5 ATV对AMI组大鼠Nrf2/HO-1水平的影响AMI组大鼠的Nrf2和HO-1水平显著低于Sham组（P＜0.05），AMI+ATV组Nrf2和HO-1水平显著高于AMI组（P＜0.05），见表3、图3。

3 讨论

AMI后的氧化应激反应和炎性反应引起的心肌细胞凋亡是AMI后损伤的主要机制，细胞凋亡在心肌缺血损伤的病理演变过程中占有重要地位，在早期急性缺血中，心肌细胞凋亡是心肌梗塞的主要形式，梗死后2～7 d的继发性凋亡也是影响AMI预后的主要原因[7]。改善氧化应激反应和抑制急性心肌缺血后的细胞凋亡是治疗AMI的主要策略。

ATV是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，多用于治疗和预防血脂异常，ATV不但可稳定心血管疾病中的动脉粥样硬化斑块，还具有多效作用，包括抗氧化和抗炎活性、改善内皮功能和降低细胞因子表达[8,9]。临床研究显示，ATV可减轻心力衰竭的症状[10,11]。另有研究显示，ATV治疗4周能减轻大鼠AMI后的心室功能障碍、纤维化和左心室肥大，提示ATV可用于限制心肌缺血事件后的心室重构[12]。本研究中，我们利用结扎法构建AMI大鼠模型，并通过ATV灌胃干预7 d。结果显示与Sham组比较AMI组的心功能严重受损，梗死面积达为（2.34±0.46）mm，且心肌细胞凋亡率显著升高，而AMI+ATV组的梗死面积仅为（1.76±0.43）mm，较AMI组小，心肌细胞凋亡率也降低，心功能得到有效保护。有研究显示，ATV可通过抑制微小RNA-199a-5p的水平保护心肌免受缺血再灌注损伤[13]。Sen等[14]研究发现ATV可通过抑制JNK3信号通路发挥缺血性脑损伤的神经保护作用。Linyan等[15]研究结果显示ATV的药理后处理可通过磷酸化GSK3β抑制凋亡，减轻糖尿病大鼠的心肌缺血/再灌注损伤。提示ATV可抑制心肌细胞凋亡，减少梗死面积，保护心功能。

表2 各组血清炎性因子和氧化应激因子的影响

表3 各组大鼠Nrf2/HO-1水平比较

图3 Western blot检测各组大鼠Nrf2/HO-1水平

为进一步分析ATV对AMI大鼠具有保护作用机制，我们检测了血清氧化应激指标、炎性因子以及Nrf2/HO-1通路的变化情况。AMI引起的心肌缺血会引起氧化应激反应，而Nrf2/HO-1通路的抑制会引起SOD、HO1等抗氧化物质水平的降低，引起细胞损伤和诱发炎性反应，研究显示，激活Nrf2/HO-1通路可缓解AMI大鼠的心肌细胞损伤[16]。本研究结果显示，与Sham组大鼠比较，AMI组的血清炎性因子、MDA水平显著升高，而血清SOD及梗死边缘组织的Nrf2和HO-1水平显著降低，AMI+ATV组大鼠的血清炎性因子、MDA水平显著低于AMI组，血清SOD及梗死边缘组织的Nrf2和HO-1水平显著高于AMI组。有研究显示ATV可通过调控Nrf2/HO-1缓解血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞炎症[17]。Sun等[18]研究结果显示ATV具有促进Nrf2/HO-1通路的作用，提示在AMI大鼠中，ATV可能通过促进Nrf2/HO-1抑制氧化应激和炎性反应。

综上所述，ATV可能通过促进Nrf2/HO-1通路抑制氧化应激和炎性反应，从而减少AMI模型大鼠的心肌细胞凋亡，保护心功能。但关于ATV对AMI的影响及调控Nrf2/HO-1通路的机制仍需进一步研究。