主动脉夹层患者主动脉壁中YWHAZ的表达改变及其临床意义

王锐，蒋丁胜，魏翔

主动脉夹层是一种发病急、进展快、病情凶险、致死率高的心血管病急症，若未经治疗，发病24 h内的死亡率约为50%，30 d死亡率可达90%[1]。有资料显示发病率约为30/100万人·年，且近年来呈上升趋势[2]。对于其发病机制，目前比较公认的是，主动脉壁中血管平滑肌细胞外基质降解导致胶原及弹力纤维蛋白退行性病变，血流冲击或直接创伤等导致内皮细胞损伤，在血管内膜上形成破口，高压血流穿透血管壁中层使其分离形成夹层[3]。但平滑肌细胞外基质降解的具体分子机制尚未完全阐明。YWHAZ是一种广泛表达的酸性衔接蛋白，分子量约28-33kDa，属于14-3-3蛋白家族，其主要分布于细胞质，自然状态下以同源二聚体或异源二聚体的形式存在[4]，通过特异性识别底物上的磷酸化基序RSXpSXP或RXXXpSXP而与该底物结合，发挥调控信号传导、影响细胞周期、抑制细胞凋亡等多种生物学功能[5]。有研究显示YWHAZ在肿瘤组织中高表达，有促进肿瘤细胞迁移的作用[6,7]，但其是否能调控主动脉平滑肌细胞的功能，以及是否参与主动脉夹层的发生发展目前尚未见报道。

1 资料与方法

1.1 研究对象及分组本研究纳入华中科技大学同济医学院附属同济医院心脏大血管外科在2017年1月1日至2018年12月31日期间收治的13例经CTA检查确诊患有Stanford A型主动脉夹层的患者为研究对象。同时纳入11例在本院接受心脏移植且无任何主动脉及相关疾病的患者为对照组。合并马凡氏综合征、创伤性夹层、肿瘤、自身免疫系统疾病以及艾滋、梅毒等高传染性疾病患者不纳入本研究。本研究经华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会批准，符合医学伦理学规定，并取得了所有受试者的知情同意，严格按照实验规范实施。

1.2 研究方法将主动脉壁组织经福尔马林溶液充分固定后脱水、包埋并切片，随后组织切片分别按照标准流程进行HE和EVG染色，使用二甲苯对切片脱蜡透明化，然后依次放入100%、95%、85%、70%乙醇以及纯水中各浸泡5 min充分水化，水化后的切片分别进行HE和EVG染色，再依次用80%、90%、100%乙醇进行脱水，二甲苯浸泡2次后用中性树脂封片，在显微镜下观察拍照。

按照标准流程进行免疫组化染色，即将石蜡切片放于烘箱中烤片60 min，使组织贴附更牢靠，二甲苯脱蜡3次，每次5 min，依次用100%、95%、70%乙醇以及ddH2O浸洗切片各5 min进行充分水合，利用柠檬酸盐进行抗原修复，滤纸吸干切片周围水分后滴加3%的H2O2放于湿盒中在37℃下孵育20 min，PBS洗涤3遍后加8%羊血清室温封闭60 min，随后加入YWHAZ特异性一抗（GeneTex，GTX101075，1:200稀释）4℃下孵育过夜，次日用PBS洗涤切片3次，每次5 min，二抗孵育60 min， PBS洗涤4次后滴加DAB工作液进行显色，显微镜下观察控制显色时间，用ddH2O浸洗3次，苏木素复染1 s，自来水冲洗10 min返蓝，再依次放入70%、95%、100%乙醇中浸片各5 min进行脱水，二甲苯透明，最后用中性树脂进行封片后于显微镜下观察拍照。

每个样品剪取约30～40 mg冻存的主动脉壁组织，在液氮冷冻条件下将组织研磨碎后收集至EP管中，每10 mg组织加入100 μl裂解液，于冰浴中静置裂解10 min，随后使用超声破碎仪进一步破碎，然后在4℃下12 000 rpm离心30 min，转移上清至新的EP管中。使用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，加入适量5×SDS上样缓冲液。95℃水浴15 min进行蛋白变性，冷却后低温保存备用。

将变性后的蛋白样品通过SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜，随后用5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST清洗PVDF膜3遍后，进行YWHAZ一抗（1:1000稀释）孵育，4℃下摇床孵育过夜。次日用TBST洗膜3次，每次5 min，孵育二抗，TBST洗涤3次，最后加入用ECL显影液充分浸湿PVDF膜后，于ChemiDocTMXRS+成像系统（Bio-Rad）中检测蛋白信号。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组比较采用独立样本t检验；计数资料以例数及百分比表示，采用卡方检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般临床资料本研究中夹层组共纳入Stanford A型主动脉夹层患者13名，全部为男性患者，平均年龄为（50.1±7.53）岁，对照组纳入心脏移植患者11例，其中男性9例，女性2例，平均年龄（50.2±11.5）岁，两组间性别及年龄均无统计学差异（P＞0.05），同时两组间的饮酒、吸烟、糖尿病、舒张压、心率等均无统计学差异（P＞0.05），说明两组纳入患者基线均衡，具有可比性（表1）。因对照组为接受心脏移植的患者，故术前未做CTA检查。

表1 主动脉夹层患者与对照组临床资料对比

2.2 患者影像学资料及病理组织切片染色纳入的夹层组患者均经CTA检查确诊为Stanford A型主动脉夹层，并进行了CT三维重建（图1），破口位于升主动脉，累及腹主动脉。HE染色结果显示。与对照组相比，夹层组主动脉壁组织中血管平滑肌细胞排列较为混乱且细胞数量减少，细胞核明显缩小（图2）。EVG染色结果可见夹层组主动脉壁弹性纤维断裂明显，并弹性纤维含量有所减少（图2）。

图1 夹层组患者CTA及三维重建图

图2 正常对照组与夹层组患者的主动脉壁组织切片H&E及EVG染色

2.3 YWHAZ在主动脉壁组织中表达量及亚细胞定位为了进一步研究YWHAZ与主动脉夹层的关系，首先采用免疫组化检测主动脉壁中YWHAZ的表达及其亚细胞定位情况，阳性面积定量分析显示：对照组0.58±0.43，夹层组4.54±0.59，P=0.00158，与对照组比较，夹层组主动脉壁组织中YWHAZ蛋白表达量明显增多，差异具有统计学意义，且大部分位于血管平滑肌细胞质中（图3）。进一步通过western blot检测YWHAZ的蛋白质表达水平，结果显示：对照组中可见YWHAZ蛋白的表达，而在夹层组患者主动脉壁中YWHAZ蛋白表达水平有一定程度的升高（图4A），趋势与免疫组化一致，检测蛋白条带灰度值并进行定量，计算YWHAZ蛋白/总蛋白比值，取对照组平均值为1，可得出相对定量对照组为1.0±0.16，夹层组为1.24±0.31，P=0.0926, 差异无统计学意义（图4B）。

3 讨论

图3 正常对照组与夹层组患者的主动脉壁组织免疫组化染色

图4 正常对照组与夹层组患者的主动脉壁组织中YWHAZ蛋白含量

主动脉夹层是一种多因素参与、涉及多个生物学过程的主动脉疾病综合征。目前的研究结果提示高血压、动脉粥样硬化、遗传性疾病以及医源性损伤等是主动脉夹层的重要危险因素[2]。主动脉夹层的病理学特征主要表现为主动脉中层退变，其中包括平滑肌细胞减少、细胞外基质紊乱、弹力纤维断裂等[8]，但影响主动脉中层退变的分子机制尚未完全明确。本研究中，我们发现YWHAZ在主动脉夹层患者主动脉壁中表达量显著升高，提示其可能参与主动脉中层退变。已有文献报道Mir-451可抑制YWHAZ/p38 MAPK信号通路抑制血管损伤后平滑肌细胞的迁移以及内膜新生[9]。除Mir-451外，YWHAZ还能被多种MirRNA调控，如在肝癌中Mir-22和Mir-613都能调控YWHAZ的表达[10,11]，Mir-22被报道能显著抑制平滑肌由收缩型向合成型转化，抑制平滑肌细胞的增殖和迁移以及血管损伤后的内膜新生[12]，同时，Mir-22也能抑制闭塞性动脉硬化症患者的血管平滑肌细胞的增殖和迁移[13]。此外，YWHAZ还可以调控多种肿瘤细胞的凋亡以及自噬[14]。在主动脉夹层的病理过程中，平滑肌细胞数量显著减少且由收缩型向合成型转化，导致平滑肌细胞数量减少的机制包括增殖抑制、凋亡增加以及过度自噬等[15,16]。因此，以上的研究成果提示YWHAZ升高可能会促进平滑肌细胞由收缩型向合成型转化，同时，也可能促进平滑肌细胞的凋亡和过度自噬，从而导致主动脉中层退变。

此外炎症细胞的浸润以及炎症因子的分泌对主动脉夹层的发生至关重要，有研究结果表明，血管紧张素Ⅱ以及异丙肾上腺素虽然都能升高小鼠的血压，但由于异丙肾上腺素并不能诱导炎症的产生，因此，只有血管紧张素Ⅱ能有效诱发主动脉夹层的发生[17]。有研究显示，Mir-451可通过YWHAZ调控炎症因子的产生[18]。因此，YWHAZ的升高可能会激活主动脉壁中的炎症信号通路，从而募集炎症细胞浸润，分泌炎症因子，促进主动脉夹层的发生发展。

综上所述，本研究发现YWHAZ在主动脉夹层患者主动脉壁中高表达，其可能通过促进平滑肌细胞的凋亡、过度自噬以及炎症反应从而促进主动脉夹层的发生发展。因此，该发现为主动脉夹层的诊断及治疗提供新的思路及分子靶点，但YWHAZ对主动脉夹层的影响以及具体的分子机制还有待进一步研究。