细胞焦亡在脓毒症中的作用及中医药干预研究进展

苗雪圆， 彭 清， 孙 柳， 高卫峰， 张庆怀， 苏延军， 张春泽,4

脓毒症是宿主对感染反应失调导致的威胁生命的器官功能障碍，其发生发展进程中包含复杂的促炎与抗炎过程，常发生于多发性创伤、严重烧伤及外科术后等。脓毒性休克作为脓毒症的一个亚型，可进一步增加死亡风险[1]。目前，脓毒症在世界范围的发病率和死亡率均较高，消耗巨大医疗资源，严重威胁人类健康。细胞焦亡属程序性细胞死亡，其特征在于释放炎性因子进而激活炎症反应，已被证实参与多种感染性疾病的发生发展。脓毒症中重要的炎症反应与焦亡典型的炎性特征提示二者间可能存在密切联系。目前研究显示焦亡在脓毒症中可能发挥重要作用，现就此作一综述，以期为脓毒症发病机制研究及治疗提供依据。

1 细胞焦亡及其分子机制

细胞焦亡是一种新型程序性细胞死亡形式，与凋亡有染色质DNA断裂、TUNEL染色阳性等相似点[2]，但又因其独特的生化及形态学特征区别于凋亡。焦亡主要由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）家族成员诱导。在焦亡过程中，细胞质膜上形成孔洞，膜两侧的离子平衡被破坏，水分子进入细胞，造成细胞肿胀、细胞膜裂解及促炎因子释放[3]。区别于凋亡的“免疫沉默”，焦亡因其促炎特性亦称作“炎性坏死”。

1.1 依赖于caspase-1的焦亡经典通路 在固有免疫中，病原体、受损组织与细胞组成物可形成病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs)和损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），二者可被模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）所识别[4]，随后诱导炎性小体组装和激活。炎性小体是焦亡过程中形成的多蛋白复合物，其形成需要受体蛋白、接头蛋白、效应蛋白的共同作用，可促进procaspase-1剪切及促炎因子白细胞介素（IL）-1β和IL-18成熟。受体凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis associated speck like protein containing a CARD，ASC）包含pyrin结构 域（pyrindomain，PYD） 和caspase结 构 域（caspase activation and recruitment domain，CARD)，可作为接头蛋白通过PYD与充当受体蛋白的PRRs寡聚，进一步通过ASC的CARD招募pro-caspase-1到炎性复合体中[5]。常见的能够充当受体蛋白的PRRs有NOD样受体（NOD-like receptor，NLR）家族（NLRP3、NLRP3等）、HIN200家族（黑色素缺乏因子2）或蛋白pyrin[6]。pro-caspase-1寡聚后诱导自身蛋白水解剪切为活化的caspase-1。caspase-1是一种半胱氨酸依赖蛋白酶，能够剪切细胞因子前体pro-IL-1β和pro-IL-18，产生具有生物学活性的IL-1β和IL-18[7]。研究发现消皮素D（gasdermin D，GSDMD）是焦亡发生过程中炎性caspase的关键底物[8]，其包含两个结构域，N端成孔结构域和C端抑制结构域，二者连接部分存在切割位点，分别位于鼠的D276和人的D275[9]。活化的炎性caspase在特定位点剪切GSDMD，形成N端和C端。N端释放后发生寡聚并插入细胞质膜，导致膜孔形成，渗透稳态失调，细胞发生肿胀、裂解及死亡[9-10]。这种依赖于caspase-1的焦亡机制称为焦亡经典通路。

1.2 依赖于caspase-4/-5/-11的焦亡非经典通路 小鼠caspase-11及人类caspase-4/-5可特异性高亲和力结合革兰氏阴性细菌细胞外壁脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）中的lipid A，从而识别LPS。二者结合后触发caspase发生寡聚及自身蛋白水解，诱导caspase激活[10-11]。因此，与炎性小体激活caspase-1不同，caspase-4/-5/-11不需要激活接头分子ASC，而是同时作为受体蛋白与效应蛋白，通过其CARD结构域与LPS直接结合[12]。活化的caspase-4/-5/-11剪切GSDMD，导致膜孔形成、质膜裂解，进而发生焦亡[10]。区别于caspase-1，caspase-4/-5/-11不剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，但在某些细胞亚群中，caspase-11可以一种NLRP3炎性小体依赖的方式诱导IL-1β低水平分泌[13]。这种依赖于caspase-4/-5/-11的焦亡机制称为焦亡非经典通路。

1.3 caspase-3切割GSDME诱导的特殊焦亡通路 近期研究发现，除炎性caspase外，某些凋亡相关caspase（如caspase-3）可通过切割与GSDMD同属Gasdermin家族的GSDME/DFNA5蛋白来诱导焦亡[14]。Rogers等[15]发现caspase-3可在GSDME的Asp270位点进行切割，产生的GSDME-N末端靶向细胞质膜，诱导凋亡细胞产生继发性坏死/焦亡。Wang等[16]证实在caspase-3活化细胞中，GSDME的表达水平决定细胞死亡形式，且化疗药物可在某些表达GSDME的癌细胞中诱导caspase-3切割GSDME，从而诱发焦亡；同时正常组织中caspase-3激活GSDME介导的焦亡可导致化疗毒性。此外，GSDME还被报道分别在胃癌[17]、结肠癌[18]、肺癌细胞[19]中介导caspase-3诱发焦亡。

2 焦亡与脓毒症的关系

炎症反应是脓毒症发生发展过程中的重要环节，而细胞焦亡独特的炎性特征提示其可能通过参与炎症反应进而在脓毒症病程中起重要作用。研究证明脓毒症中的许多焦亡相关因子表达水平发生显著变化。

2.1 焦亡相关因子NLRP3/caspase-1表达水平对脓毒症的影响 脓毒症病理生理的初级阶段会产生一些信号分子，例如DAMPs和PAMPs，它们与PRRs相互作用并招募免疫细胞。其中，NLRP3通过识别DAMPs和PAMPs，形成多蛋白复合物—NLRP3炎性小体，参与宿主免疫反应。NLRP3炎性小体主要包括NLRP3、ASC、pro-caspase-1三个成员[20]。NLRP3活化后与ASC相互作用，然后招募pro-caspase-1，促使其剪切活化；活化的caspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18成为成熟的IL-1β和IL-18，进而促进炎症反应。Sun等[21]发现NLRP3/ASC/caspase-1通路可在巨噬细胞中诱导焦亡，且目前许多研究显示NLRP3炎性小体与caspase-1在脓毒症中起重要作用。

临床病例研究中，Esquerdo等[22]利用逆转录聚合酶链式反应检测27例继发性脓毒症患者入院时（D0）与入院随访7天后（D7）外周血单核细胞中的基因表达情况，结果发现与11例健康对照相比，脓毒症患者的NLRC4、NLRP3、IL-1β和IL-18表达水平显著增高，且非幸存患者的水平高于幸存患者，表明参与NLR炎性小体级联反应的基因表达水平在脓毒症中发生改变。Watany等[23]用ELISA检测149例受试者血清中IL-31、IL-1β、NLRP3的水平，结果提示三者间相互关系可能成为系统炎症反应综合征、脓毒症及脓毒性休克的诊断依据及预后指标。

动物与体外实验方面，Cao等[24]采用盲肠结扎穿孔法（CLP）构建脓毒症小鼠模型，发现肾脏组织中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18及血清中IL-1β、IL-18表达水平均增高，且CLP小鼠血压降低、血清肌酐及肾脏内中性粒细胞浸润水平增高；敲除NLRP3基因或加入caspase-1抑制剂可显著降低ASC、caspase-3、IL-1β及IL-18表达水平，同时逆转CLP小鼠的肾脏损伤，证明NLRP3与caspase-1参与脓毒症诱发的急性肾损伤（AKI）。穆晓琨等[25]研究NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18轴在CLP大鼠中的作用，也证明NLRP3炎性小体的活化对脓毒症AKI具有促进作用。还有研究显示CLP小鼠肝组织中NLRP3、caspase-1和血清IL-1β、IL-18表达水平呈时间依赖性增高，同时血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平及肝细胞焦亡率均高于假手术组；注射NLRP3和caspase-1抑制剂可使血清IL-1β、IL-18浓度显著降低，肝细胞焦亡率下降，肝损伤逆转，且结果与体外细胞模型保持一致[26]。除NLRP3/caspase-1/IL-1β/IL-18之外，关于脓毒症相关性脑病的研究显示，焦亡关键执行蛋白GSDMD的表达量在CLP小鼠海马区中显著升高[27]。此外，NLRP3炎性小体还被证明有助于激活小鼠脓毒症早期内皮功能障碍[28]。

以上结果证明NLRP3及caspase-1活化与脓毒症的发生发展具有密切关系，抑制NLRP3与caspase-1可成为防治脓毒症的关键。然而，Zhong等[29]发现NLRP3在多菌腹腔感染中起保护作用，CLP小鼠NLRP3缺失会导致IL-1β水平下降、多器官细菌负荷量增多、腹膜腔中性粒细胞招募受损且降低生存率，提示NLRP3在脓毒症中可能具有双重作用。

2.2 焦亡相关因子caspase-11表达水平对脓毒症的影响革兰氏阴性菌外膜的主要成分LPS，作为自然界最有效的免疫刺激化合物之一，可通过在固有免疫系统中过度活化进而在脓毒症中起作用。LPS诱导的焦亡是内毒素休克的主要诱发因素，且可能造成脓毒症晚期的免疫抑制及器官功能障碍，caspase-4/-5/-11作为LPS受体在此过程中起关键作用[30]。Ye等[31]分别构建脓毒症AKI的体内外模型，结果显示与对照相比，实验组的caspase-11、GSDMD、IL-1β及血清肌酐水平增高，敲除caspase-11可降低其表达量，且体内外实验结果一致，提示caspase-11诱导的肾小管上皮细胞焦亡是脓毒症AKI中的关键事件，而敲除caspase-11可减轻其焦亡。还有研究发现LPS可与肝细胞释放的高迁移率族蛋白-1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）结合，并通过高级糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）介导的内化作用裂解，进入细胞质并激活caspase-11；中和细胞外HMGB1、抑制HMGB1释放及RAGE受体缺失可抑制内毒素血症和脓毒症中caspase-11依赖的焦亡和致死性，说明HMGB1与LPS相互作用可诱导脓毒症中caspase-11依赖的焦亡[32]。此外，环磷酸腺苷[33]、氧化磷脂[34]、丙酮酸乙酯[35]均被报道可调节脓毒症中caspase-11依赖的细胞焦亡。

3 中医药通过调控焦亡效应干预脓毒症

脓毒症是机体对感染性因素的应答，通过激活炎性细胞释放大量炎性介质，故炎症反应贯穿其发生发展过程。因与许多中医温热病具有相似症状，脓毒症属中医“热病”范畴，其主要病机为正气不足，温毒炽盛，毒瘀互结[36]。研究证实中医化瘀解毒法可通过抑制细胞焦亡进一步改善炎性损伤[37]，提示焦亡可能与脓毒症病理产物中的淤毒存在相关性。中医古籍中并未出现“炎症”一词，只提及炎烁[38]，炎症介质属中医“毒邪”范畴。中药治疗炎性疾病，不仅药理研究发现某些中药成分确有抗病菌、抗炎、调节免疫等作用，此外，中药还可通过调整机体内环境防治炎症疾病[38]。近期许多研究显示中药单体及复方可通过调节焦亡相关炎性因子减轻焦亡效应，从而调控脓毒症。

3.1 中药复方抑制焦亡相关炎性因子干预脓毒症 通腑宣肺汤可降低脓毒症急性肺损伤患者的血清IL-1β、IL-18、核因子-κB（NF-κB）水平，且明显改善患者呼吸功能[39]。张涛等[40-41]分别用通腑泻肺汤治疗脓毒症急性肺损伤大鼠及临床肺系脓毒症患者，发现NLRP3、ASC、caspase-1表达水平均下调，且在临床试验中下调程度优于西医常规治疗方案。LPS处理RAW264.7细胞后caspase-11和caspase-1的表达显著升高，以黄连解毒汤干预可使两种蛋白表达水平明显受到抑制，提示黄连解毒汤有效组分可能抑制LPS激活caspase-11，减少细胞焦亡[42]。

3.2 中药单体抑制焦亡相关炎性因子干预脓毒症 此外，一些中药单体也可调节脓毒症及多种脓毒症并发损伤。二氢杨梅素可显著减少CLP小鼠肺组织损伤及炎性细胞浸润， 降 低 NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18表达水平，提示其通过抑制NLRP3炎性小体依赖的细胞焦亡减轻脓毒症急性肺损伤[43]。杨梅苷可降低CLP大鼠NF-κB、caspase-3、NLRP3、IL-1β、IL-16、肿瘤坏死因子（TNF-α）的表达水平，减少大鼠脑组织的炎症和氧化应激介质，保护神经元功能[44]。百里醌可显著抑制p62、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α表达，提示其可能通过调节自噬和焦亡对脓毒症诱发的心脏损伤起作用[45]。Chunzhi等[46]通过LPS诱导建立脓毒症AKI小鼠模型研究金丝桃苷的作用，结果显示金丝桃苷显著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的生成以及血尿素氮和肌酐水平，通过抑制Toll样受体4（TLR4）和NLRP3信号通路抑制AKI炎性反应。6-姜酚可抑制CLP小鼠NLRP3、IL-1β、caspase-1表达，同时降低小鼠出现严重肝脏炎症和死亡的几率，体外实验也显示其可以降低LPS和ATP诱导的RAW264.7细胞中的焦亡效应[47]。Xie等[48]发现黄芪甲苷IV（AS-IV）可减少CLP小鼠细胞因子释放，降低肠组织屏障通透性和小鼠死亡率，体外用AS-IV处理Caco-2细胞也可降低细胞因子水平，提高肠屏障功能；此外，CLP小鼠肠组织和体外Caco-2细胞中的NLRP3炎性小体和RhoA蛋白被高度活化，而在AS-IV治疗后均被显著抑制，使用RhoA激动剂CN03及过表达NLRP3可分别抵消AS-IV治疗对Caco-2单层屏障的作用。以上结果提示AS-IV可能通过抑制RhoA/NLRP3信号通路保护脓毒症引起的屏障功能失调中的肠上皮细胞。除以上结果外，长叶薄荷酮[49]、青蒿素[50]、胡黄连苷2[51]、姜黄素[52]、野黄芩苷[53]均被报道可通过调节NLRP3活化干预脓毒症。

4 结语

综上，细胞焦亡是一种区别于凋亡、自噬、坏死的程序性细胞死亡新形式。细胞焦亡虽可抵御部分微生物感染，但其过度激活会加重脓毒症和脓毒性休克。目前许多研究证实NLRP3/caspase-1及caspase-11等可能诱导焦亡参与脓毒症发病进程，但关于诱导焦亡的其他caspase家族成员报道较少，尤其缺乏对焦亡关键执行蛋白（GSDMD等）的相关报道。中医药干预焦亡可能成为脓毒症治疗的重要手段，但相关研究仍处于初级阶段，且多集中于NLRP3/caspase-1依赖的分子机制，后期研究可着眼于诱导焦亡的其他关键因子。此外，实验中多采用敲除基因或加入抑制剂等方法抑制焦亡减轻脓毒症炎症反应，该措施在临床治疗中存在应用困难。因此，寻找能够应用于临床的焦亡抑制方法作为脓毒症治疗手段，是今后研究中需要关注的重点。