环状RNA与结直肠癌相关性研究进展

李 轩， 荣宝海， 解广东， 张晓双， 赵 微， 周永坤

结直肠癌是临床上常见恶性肿瘤之一,据世界卫生组织调查,结直肠癌在各类恶性肿瘤的发病率高居第3位[1]。I期、Ⅱ期结直肠癌检出后5年生存率分别为91%和82%，癌细胞扩散到临近器官及淋巴组织后5年生存率降至70%以下，癌细胞播散到远处器官的5年生存率下降至12%，然而早期患者的检出率不足40%[2]，因此，寻找一种更早的、更确切的结直肠癌筛查方法已成一个亟待解决的任务。

环状RNA（Circular RNA，circRNA）作为一种新型的RNA分子，以共价闭合环结构存在，与传统线性RNA相比没有5’端的帽子结构和3’端 poly(A)尾巴[3]，这种特有的结构具有高稳定性的特点，使其能够抵抗RNA外切酶的水解作用，在细胞中能够持续稳定表达[4]。CircRNA在肿瘤中能特异性表达，发挥癌基因或抑制癌基因的作用，与肿瘤的原发灶生长、远处转移、分期等密切相关[5]。因此circRNA有成为结直肠肿瘤早期诊断的生物标记物的潜力，并有希望成为结直肠癌新的治疗靶点。

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1 环状RNA的生物特性

CircRNA的生物特性主要有以下几个方面：（1）稳定性。circRNA以共价闭合环结构存在，没有帽子和尾巴结构。这种特有的结构具有高稳定性的特点，使circRNA能够抵抗RNA外切酶的水解作用，与其他类型的RNA相比，circRNA在细胞中能够持续稳定表达。（2）多样性。CircRNA种类繁多，广泛存在于真核细胞中，在人类成纤维细胞中通过高通量测序技术检测到超过25000种circRNA，某些情况下circRNA的表达甚至超过其相应线性mRNA的10倍以上[6]。（3）保守性。多数circRNA中的序列在进化上是保守的，研究人员不仅探明哺乳动物的circRNA序列具有保守性，而且在进化较远的果蝇上保守性也得到了证实[7]。（4）特异性。同一种circRNA在不同时期或者不同组织中的表达可以存在很大差异，同样在疾病和非疾病组织中的表达有显著不同[8]。例如DOCK1基因的circRNA于乳腺癌细胞系Mcf7中呈现高表达，但在肝癌细胞系Hep G2和肺癌细胞系A549中却表达极低[9]。因此CircRNA的特异性是运用于临床疾病诊断标志物的基础。

2 环状RNA的生物学功能

2.1 竞争的内源性 RNA或miRNA海绵作为内源性RNA, circRNA内部含有相关miRNA的应答元件，可以通过miRNA结合位点的竞争来负性调控miRNA的活动[10]。例如人类circRNA-7和Y染色体性别决定区(sexdetermining region of the Y, SRY)就经典的体现了miRNA海绵效应。Hansen等[11]研究发现小鼠的性别特异性基因sty circRNA可以竞争性结合miR-138来调控其表达水平。同样，circHIPK3作为miR-124海绵，能有效抑制miR-124在癌细胞中的功能，从而促进癌细胞的增殖[12]。

基于合法性的一般理论，社会组织在社区治理中的合法性应由社区治理的制度环境和利益相关者界定。借助Scott的规制合法性、规范合法性、认知合法性三分法，在社区治理中社会组织的三种合法性应当分别有不同的表现形式(见表1)。基层政府部门、社区自治主体(社区居委会)、社区其他治理主体和社区居民都是重要的利益相关者。社会组织需要通过得到这些主体以及这些主体之间长期作用形成的环境的接纳、认可，获得合法性，包括认可其作为社区治理主体资格与地位、认同其行动和作用等方面。社会组织在社区治理中的合法化过程围绕这些被认可的结果展开行动。

2.4 翻译蛋白质或多肽 大多数反向剪接产生的circRNA主要存在于细胞质中，线性mRNA翻译通常需要5'端帽子和3'端poly（A）尾巴的结构来保持稳定。circRNA通常情况下不被认为具有翻译功能。但Chen 等[15]研究发现若circRNA具有内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site, IRES）时，就可以在细胞中启动翻译功能，通过测试部分人工合成的circRNA，发现其含有IRES，说明这些circRNA很可能有编码蛋白质的功能。这种方式可以提供更多的多肽序列，并且因为核糖体不需要与RNA模板重复结合，因此还可以提高多肽的产量[16]。角质细胞瘤中，circ-FBXW7能够编码产生蛋白，尽管circ-FBXW7及其编码的蛋白表达水平较低，但其蛋白能够抑制恶性胶质瘤细胞的增殖和细胞的周期进展[17]。CircRNA的翻译以及在肿瘤组织中的调控作用极有可能为circRNA的研究提供新的思路。

2.3 调控亲代基因的表达 CircRNA可以调节亲代基因组的转录。虽然大多数circRNA位于细胞质中，但有部分circRNA如ElciRNA(外显子-内含子circRNA)基本位于真核细胞的细胞核内，在转录水平上有发挥作用的倾向。Li[14]等人发现约20%的ElciRNAs保留内含子，使得这一亚类的circRNA更为独特，同时具有ElciRNA和ciRNA（内含子circRNA）的功能。ElciRNA定位于细胞核内，与U1小核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein particle, snRNP）相互作用来促使其亲本基因的转录，通过ElciRNA与U1snRNA的RNA-RNA特异作用，增强亲代基因的顺式表达；另外，有一部分ElciRNA在细胞核转录位点之外的区域聚集，提示这部分ElciRNA可能通过反式作用方式调控转录。

3.1 环状RNA成为结直肠癌诊断标志物 Lin等[19]将健康组与结直肠癌患者组血浆中三种circRNA（circ-CCDC66,circ-ABCC1，circ-STIL）对比发现，结直肠癌患者的三种circRNA水平显著降低，且三种circRNA的ROC曲线下面积（AUC）为0.780，高于癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA19-9）等传统蛋白质生物标志物。将circRNA与CEA、CA19-9联合应用，可以调高结直肠肿瘤的诊断能力（AUC=0.855）。此外结肠腺瘤、腺瘤性息肉等癌前病变的血浆circ-CCDC66, circ-ABCC1水平降低，为结直肠癌的更早期诊断提供了可能，同时三个circRNA小组提高了CEA阴性和CA19-9阴性的结直肠肿瘤的诊断能力。Wang等[20]发现circ_001988的表达与结直肠癌的分化及神经浸润相关（P＜0.05），并且circ_001988的ROC曲线下面积为0.788，表明circ_001988很可能成为结直肠癌的新型诊断标志物。这些研究表明环状RNA在结直肠癌的早期监测筛查方面的潜力，通过与传统蛋白质生物标志物结合，提高了诊断的特异性和准确性。

3 环状RNA与结直肠癌相关性

3.4 环状RNA调控结直肠癌细胞微环境 Zhang等[35]研究表明缺氧可以刺激癌症的转移，缺氧与缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor, HIF）家族的表达有关，缺氧时HIF可促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌，VEGF促进心血管网络的生成，进而为癌细胞提供氧气与营养物质[36]，从而促进了癌症的EMT。缺氧环境下T淋巴细胞的毒性作用被削弱，减轻了T淋巴细胞抑制癌症转移并诱导癌细胞凋亡的作用[37]。Dang等[38]发现Cric-001072可以通过调控miRNA-186/HIF-1α通路来影响血管内皮细胞的迁徙，从而推动癌症的转移。环状RNA可以通过影响癌细胞的缺氧环境来调控癌症的EMT。

2.2 生成RNA蛋白复合物来调节RBP RNA结合蛋白（RNA Binding Protein，RBP）是RNA在调节代谢过程中产生的,其涉及基因转录翻译等重要过程。CircRNA可与RBP直接结合形成RNA蛋白复合物对RBP起调节作用，形成多种特异性的circRNA,进而影响相关蛋白，发挥调节作用。剪接因子MBL（muscleblind-like）是一种RBP，在果蝇与人类中都可以结合其亲本基因的第2外显子，促使其环化形成circMbl，circMbl同时能与MBL结合来降低MBL的丰度，从而减少circMbl的生成[13]。

以上circRNA生物学特性，提示我们circRNA可能在转录或者转录后水平发挥作用，通过编码蛋白质或者调控基因转录来发挥其生物学功能，参与结直肠肿瘤的发生发展、增殖转移等过程。

3.2 环状RNA与结直肠癌的发生 Circ-0024717在试验中被证实在结直肠癌中的表达下调，并与TNM分期和患者的总体生存率显著相关。Circ-0024717的过表达可以明显抑制结直肠癌细胞的增殖和集落的形成，并在体外诱导细胞停滞在G0/G1期。并且circ-0024717能通过上调细胞周期抑制蛋白P16的表达来抑制结直肠肿瘤的生长与增殖[21]。Circ-0067835来自于3号染色体上的IFT80，又称为circ-IFT80。Feng等[22]研究58例结直肠癌中circ_IFT80的表达，发现circ-IFT80在结直肠癌的血清外泌体、结直肠癌组织和结直肠中细胞系中显著上调。通过荧光素酶报告基因实验证实，circ-IFT80、HOB7与miR-1236-3P负相关，circ-IFT80与HOXB7呈正相关共同促进结直肠癌的发展[23]。可见结直肠癌细胞的发生和生长与环状RNA密切相关。

使用统计学软件SPSS 21.0中导入本次数据进行处理和分析,以(±s)表示计量资料,组内比较和组间比较分别用配对样t和独立样本t检验,计数资料以x2检验,当P<0.05时,存在明显差异,统计学具有意义。

3.3 环状RNA与结直肠癌的增殖转移 Xie等[24]发现circ-001569能够抑制结直肠癌的细胞增殖和侵袭。Circ-001569作为海绵与miR-145结合并抑制其转录，上调miR-145靶点即FMNL2的表达，FMNL2能够促进结直肠癌细胞的增殖、转移、侵袭和上皮-间质转化。Circ-0026344被证实与大肠癌的增殖侵袭、上皮-间质转化（EMT）显著相关[25]，circ-0026344的下调促进了miR-183，miR-183的高表达被证实与结直肠癌淋巴结转移、远处转移、高pTNM分期和肿瘤复发相关[26]。CCL20和CXCL8被证实协同诱导结直肠癌的转移与EMT[27-28]，并降低circ-0026344的表达，而circ-0026344的过表达则会抑制CCL20和CXCL8协同诱导作用。circ-0001178[29]高表达的结直肠癌患者更容易出现转移，研究显示circ-0001178通过海绵化miR-382、miR-587、miR-616上调ZEB1来促进上皮-间质转化[30]，从而推动肿瘤的转移扩散。另外ZEB1会通过与circ-0001178启动子区结合增加circ-0001178的表达。Pei等[31]采用双荧光素酶报告法与RIP法证实circ-0000218在结直肠癌中呈现高表达，circ-0000218通过海绵化miR-139-3P上调RAB1A促进结直肠癌的发展[32-33]。Circ-0000218的高表达明显促进TNM分期，抑制circ-0000218时则相反。Wang等[34]发现circ-0000567的表达水平在结直肠癌组织和结直肠细胞系中明显下调，circ-0000567的降低与结直肠肿瘤的大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期呈负相关。此外，在体外试验中敲除cir-0000567基因后促进了结直肠肿瘤的增殖与转移。结直肠癌的增殖转移与环状RNA关系密切，环状RNA通过circRNA-miRNA-mRNA轴来控制结直肠癌细胞的增殖转移，可以作为控制结直肠癌细胞功能的手段，为环状RNA在结直肠癌治疗方面提供了新的研究思路。

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近期邵婧娴[18]等利用circRNA芯片得出结直肠癌组织与对应癌旁组织circRNA表达谱变化，研究结果表明差异表达2倍以上的circRNA共有892条，肿瘤组织相对高表达的有412条，低表达的有480条，其中降低10倍以上差异的有6条，升高10倍以上差异的有40条。可见circRNA在结直肠肿瘤领域的研究大有潜力。

3.5 环状RNA有望成为结直肠癌治疗靶点 Circ-ITGA7是由ITGA7的外显子4反向剪接衍生出的一种新circRNA，其对应的线性ITGA7通过线性剪切而成[39]。Li等[40]通过实验研究证明circ-ITGA7在结直肠癌组织和细胞系中均显著下调，且表达水平的降低与结直肠癌生长相关，circ-ITGA7与ITGA7的表达可以抑制结直肠细胞的生长与转移。Circ-ITGA7或ITGA7的下调促进了结直肠肿瘤细胞的增殖和转移。Circ-ITGA7通过与miR-370-3p竞争性结合，从而促使ITGA7的转录，Yang等[41]还发现Circ-ITGA7可以海绵miR-3187-3p进而上调ASXL1，以此来抑制结直肠癌细胞的增殖与转移，提示Circ-ITGA7可以成为结直肠癌的潜在治疗靶点。Wu等[42]证实Circ-ZNF609和Gli-1在结直肠癌中的表达显著上调，miR-150明显下调。通过相关性分析法得出circ-ZNF609与Gli-1呈正相关，miR-150与circ-ZNF609和Gli-1呈负相关。并且下调的circ-ZNF609抑制人结直肠癌细胞（HCT116）的转移，敲除circ-ZNF609后通过miR-150过度表达从而降低Gli-1并抑制癌细胞的转移[43-44]，为结直肠癌靶向治疗研究提供了思路。Li等[45]通过实验测定88例结直肠癌组织和细胞系发现其中circ-FMN2的表达明显上调，circ-FMN2基因敲除后抑制了癌细胞的增殖和迁徙,证明circ-FMN2有望成为新型治疗靶点。敲除部分环状RNA已被证实可以影响癌症的进展，为进一步研究新型靶向药提供了理论依据，成为结直肠癌基因治疗的新突破。

3.6 环状RNA预测结直肠癌术后复发 有数据显示，约有20%至30%的结直肠癌患者术后出现肿瘤复发,从而导致患者生存率下降[46]。对结直肠癌患者进行准确的风险分析是术后治疗决策的关键。目前常用临床病理分期来判断患者术后复发风险，然而这种方法并不充分[47]。CicrRNA具有进化保守、组织特异性表达、比线性miRNA更稳定的特点[48-49]。已被证实可以作为结直肠癌的新型诊断标志物[50-52]。Ju等[53]对667例结肠癌患者术后冰冻组织RNA序列进行分析，分析术后复发性结直肠癌患者和术后无复发性结直肠癌患者的circRNA表达差异，发现了circ-0122319、circ-0087391、circ-0079480及circ-0008039四组RNA能够可靠预测结直肠癌的术后复发。我们可通过以上四组环状RNA来区分结直肠癌术后患者复发风险的高低，以便对患者进行精细化治疗。

CGA可以在多个场所进行，由于目的及人群不同，往往评估的侧重点、量表的种类和评估干预的流程有所不同。根据不同的场所，分为针对综合医院住院患者的CGA（老年急性医疗单元、老年医学评估和管理单元、老年康复单元），出院时的转诊医疗CGA、社区居家管理CGA和老年综合评估门诊（geriatric evaluation and management clinic，GEM-clinic）。CGA应用于老年人连续医疗的各个环节，衰弱、失能、共病老年患者获益最大［4］。

3.7 环状RNA与结直肠癌的预后 有研究显示结直肠癌组织和细胞系中circ-0136666呈显著高表达，circ-0136666的高表达还与结直肠癌患者的总体生存率低相关[54]。Hsiao等[55]发现circ-CCDC66在结直肠癌和息肉中的表达明显上调，实验证明结直肠癌细胞中circ-CCDDC66通过调控多个癌基因参与细胞增殖、侵袭等多个病理过程，且与结直肠癌的不良预后相关。因此，环状RNA可以更精确地预测患者的总体生存率及预后。

4 展望

近年来大量circRNA的发现，已成为分子生物学的研究重点。目前circRNA研究还没有一套规范的体系，部分circRNA有些混乱。此外现有的circRNA作用机制假说也比较局限，多数研究将circRNA的作用机制归纳为circRNA-miRNA-mRNA轴[56-58]，这种假说尚未被证实适用于大多数RNA。已有研究证实circRNA参与了结直肠肿瘤的增殖转移以及化疗药物耐药[59-60]，相信随着circRNA对肿瘤影响机制的进一步阐明，circRNA将极有可能成为新的结直肠癌症治疗靶点，为开发新型高效的抗肿瘤药物的治疗提供方向和思路。临床诊断方面circRNA拥有极高的研究价值。因其独特的闭合环状结构，可以抵抗核酸外切酶的降解作用，在体液中有更稳定的性能，在唾液、血浆、尿液以及外泌体中都能稳定存在[61-63]，并且具有组织特异性表达的功能，日后有可能代替CEA、CA19-9成为新型肿瘤诊断标志物[64]。随着circRNA与肿瘤影响机制的进一步研究，将会有更多在结直肠癌的差异表达circRNA被发现。可以预见的是随着circRNA的高通量测序和生物芯片技术的普及与发展，circRNA未来会从实用性和经济性上被人们认可,在肿瘤的早期诊断和精准治疗上造福人类。