基于组学技术的冠心病血瘀证候研究进展

赵梦竹，吕双宏，王恒和*

(1.天津中医药大学第一附属医院，天津 3001932;2.国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300193)

2018年《中国心血管病报告》[1]中指出2016年中国城市居民冠心病(coronary heart disease，CHD)死亡率为113.46/10万，且呈上升趋势，冠心病的防治迫在眉睫。中医药在冠心病防治中具有独特的优势[2]，能够改善患者的生活质量，减轻焦虑抑郁状态，减少再住院率。中医药防病、治病的精髓在于辨证论治，辨证准确、规范，疗效事半功倍。但是，传统的中医辨证体系客观依据较少，中医证候诊断的主观性较强，给中医临床辨治带来一定困难。因此，其规范化、标准化亟需解决。多年来，中医和中西医结合工作者在中医证候客观化、规范化研究方面做了大量工作，其中对血瘀证的研究较多。血瘀证是冠心病最为常见的证候类型，目前对血瘀证[3]的诊断标准日趋完善，近几年来基于三大组学技术的血瘀证候研究为冠心病的中医临床辨治提供了重要参考，综述如下。

1 冠心病血瘀证基因组学研究

1.1 CHD血瘀证与CYP2C19*2基因

张娅等[4]采用PCR-RFLP法对冠心病PCI术后气虚血瘀证患者外周静脉血进行CYP2C19*2基因多态性检测并进行单因素分析，以非气虚血瘀证组为参照进行多因素Logistic回归分析，发现气虚血瘀证组CYP2C19*2基因突变型(GA+AA)高于非气虚血瘀证组，且相对危险度(OR)为2.465，提示冠脉介入术后CYP2C19*2基因突变可能是易患气虚血瘀证的原因。胡樑臣等[5]对冠心病不同程度血瘀证患者CYP2C19*2基因多态性进行探究发现，重度血瘀证患者发生基因突变的例数、应用氯吡格雷治疗后不良反应情况多于轻度血瘀证者，提示CYP2C19*2基因多态性、氯吡格雷抵抗与重度血瘀证有密切联系。

1.2 CHD血瘀证与ACE基因

李琳等[6]对早发冠心病血瘀证患者ACE基因选取3个单核苷酸多态性rs4343、rs4293和rs4267385进行相关性研究，发现ACE基因多态性位点rs4293、rs4267385的基因型相似，与健康对照组比，位点rs4343中G等位基因频率高且携带G等位基因者患早发CHD的风险是非G等位基因携带者的3.6倍，对性别、年龄、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)等风险因素用Logistic回归分析进行校正后仍具有统计学意义，OR值为3.994，这提示ACE基因位点rs4343(G2350A)多态性可能是早发CHD发病的危险因素之一，但可能不是早发CHD血瘀证的易感因素。胡志希等[7]研究发现早发CHD血瘀证DD基因型及D等位基因频率明显高于早发CHD非血瘀证及正常对照组，并对一氧化氮(NO)及内皮素(ET)进行检测，发现早发CHD血瘀证患者ET/NO检测值明显高于早发CHD非血瘀证及正常对照组，且以DD型血瘀证患者最高，表明ACE基因DD基因型及D等位基因与早发CHD血瘀证发病相关，DD基因型是早发CHD血瘀证的独立危险因素，可增加早发CHD的风险，D等位基因是早发CHD血瘀证的易感基因。宋曙霞等[8]在探究CHD血瘀证患者血管病变数与ACE基因多态性的相关性研究中发现ACE基因DD、I/D型患者血管狭窄支数较Ⅱ型多，其血瘀程度亦较重，提示CHD血瘀证患者血管病变数与ACR基因多态性有关。李建军等[9]运用PCR方法对冠心病血瘀证患者测定ACE基因多态性和eNOS基因G894T变异，并以冠心病非血瘀证患者为对照，比较其基因频率，发现冠心病血瘀证患者ACE基因DD、I/D型者病情严重程度较Ⅱ型高，存在多支病变。

刘南等[10]研究发现在我国汉族急性心梗后患者中发生心室重塑与ACE基因多态性有关，提示ACE基因多态性可能是其独立危险因素。李杰等[11]采用单体型相对风险分析(HHRR)和连锁不平衡检验(TDT)的方法对湖南地区汉族人群冠心病血瘀证家系患者ACE基因I/D多态性进行探究发现，ACE基因I/D多态可能是冠心病血瘀证的发病危险因素之一，但在冠心病血瘀证家系中尚未发现与冠心病血瘀证及与疾病基因座存在关联、连锁，推测基因座可能不是湖南汉族人群冠心病血瘀证的遗传易患基因。

1.3 CHD血瘀证与IL-6/8基因

郑景辉等[12]采用PCR-RFLP的方法以健康组人群为对照，研究IL-8基因-251(A/T)位点单核苷酸多态性(SNP)与冠心病血瘀证遗传易感性的关系，发现IL-8-251A/T多态性位点各基因型频率和等位基因频率在CHD血瘀证组中具有明显差异，且在有家族史的CHD血瘀证组中AT型基因提高患病风险，0R值为4.350，表明IL-8-251A/T SNP AT基因型可增加家族聚集性冠心病血瘀证的易感性。陈光等[13]采用重亚硫酸盐对冠心病不稳定性心绞痛患者(血瘀证和非血瘀证各6例)外周血进行处理并检测两组IL-6基因启动子区甲基化状态发现:IL-6基因转录起始位点前-1 118 bp至-826 bp序列中7个位点CpG位点甲基化程度血瘀证组存在高于非血瘀证组的趋势，但统计学差异不明显，IL-6基因转录起始位点前-1 47 1 bp至-1 184 bp序列4个CpG位点甲基化程度血瘀证组与非血瘀证组之间的差异尚不明显，此研究认为IL-6基因启动子甲基化水平在一定程度反映了尿酸(UA)血瘀证本质。

1.4 CHD血瘀证与ApoE基因

陈伶利等[14]采用PCR-RFLP、HHRR和TDT方法，对湖南地区汉族人群中冠心病血瘀证患者ApoE基因多态性进行检测及分析发现：早发冠心病血瘀证、非血瘀证均与ApoE基因的ε4基因多态性关联，且二者可能均与ApoE的ε4等位基因点连锁，推测该基因座可能为湖南地区汉族人群早患冠心病的遗传易感基因。韩旭等[15]采用基因测序的方法对118例不同证型(阴寒凝滞证、痰浊壅塞证、心肾阴虚证、阳气虚衰证、心血瘀阻证、气阴两虚证)的冠心病患者ApoE基因多态性进行检测，检出3种纯合子E2/2、E3/3、E4/4，3种杂合子E2/3、E2/4、E3/4；且与对照组相比，冠心病组E2/4、E3/4、E4/4，ε4等位基因分布频率增加，E3/3基因型、等位基因分布频率ε3较其频率减少；表明ε4等位基因是CHD发生的遗传易患因素，并可能与CHD患者心脏事件的发生、发展和预后密切相关；ε3等位基因则为CHD发生的保护因素。袁肇凯等[16]团队研究亦发现冠心病心血瘀证组的ε4等位基因和E3/E4基因型的频率高于对照组，且与血脂相关的TC、TG、LDL-C等3项指标与ApoE-E3/E4都存在着关联(P<0.05)。

1.5 CHD血瘀证与其他基因

李杰等[17]采用PCR-VNTR方法对冠心病血瘀证PAI-1基因多态性基因座基因型进行鉴定，利用核心家系资料进行用HHRR、TDT对核心家系资料进行分析发现：冠心病血瘀证与PAI-1的CA18基因多态性有关联或存在连锁，非血瘀证与PAI-1的CA20基因多态性无关联且无连锁；结果表明PAI-1的CA18等位基因座可能为湖南汉族人群冠心病血瘀证的遗传易患基因。Zheng GH等[18]采用多重SNaPshot技术，以健康人为对照，对中国汉族人群血小板活化因子受体(PAFR)基因rs5938、rs313152、rs76744145多态性与冠心病(CHD)和血瘀证(BSS)的相关性进行探究发现：PAFR基因rs5938或rs313152多态性可能是中国汉族人群冠心病尤其是冠心病的BSS易感性的潜在生物标志物。薛梅等[19-20]对北京、河北地区汉族冠心病患者血小板膜糖蛋白IIIa PLA基因、GPIbHPA-2基因多态性进行研究发现：GPIIIa PLA1/PLA2多态位点，GPIb的HPA-2多态位点不是汉族人冠心病和冠心病血瘀证的危险因素，相关的易感基因可能存在于其他多态位点中。徐长福等[21]采用PCR-RELP的方法对浙江局部地区汉族冠心病血瘀证患者的基质金属蛋白酶-3(MMP-3)基因多态性进行检测，发现血瘀证组患者5A等位基因频率高于对照组，提示MMP-3-1612 5A/6A基因多态性与血瘀证相关，5A等位基因可能是血瘀证遗传易感基因。廖江铨等[22]采用高通量测序技术，荧光定量PCR技术筛选出与CHD血瘀证相关的39个lncRNA，229个miRNA和221个mRNA，并进行功能通路分析，发现与免疫、炎症有关的lncRNA-miRNA-mRNA差异表达基因谱构建了基因调控网络，CTA-384D8.35，CTB-114C7.4，RP11-567M16.6和hsa-miR-3158-3p为该网络中的关键节点。谭光波等[23]研究发现vWF基因MspI多态性中，M-M-基因型与M-等位基因与冠心病血瘀证发生相关，且可能为其独立危险因素；Fg基因-148多态性中，TT基因型与冠心病血瘀证发生相关，T等位基因可能与冠心病发生相关。

2 冠心病血瘀证代谢组学研究

代谢组学在整体性、系统性及动态性方面与中医学整体观念、辨证论治的特点不谋而合。基于此，有学者[24]提出了“证治代谢组学”假说，即机体受各种致病因素的刺激和影响后人体代谢网络功能发生特异性变化，不同中医证候以及辨证论治后存在体内代谢物组方面的特征性差异；并以冠心病为研究载体，以“证”为切入点，阐释了“证治代谢组学新假说的概念与内涵、背景、依据、实践思路、特色及临床意义”，为冠心病中医证候代谢组学研究提供了理论参考。冠心病血瘀证代谢组学研究较多，其新近代表性研究如下。

2.1 血浆代谢组学研究

2.1.1 核磁共振法

史琦等[25]用核磁共振法对冠心病血瘀证患者血浆进行检测，以非血瘀证、健康组为对照，筛选出2种特异性代谢产物：缬氨酸和丙酮，这提示冠心病血瘀证的异常代谢可能涉及氨基酸和脂质代谢过程。张红栓等[26]对冠心病患者血浆进行检测发现血浆中低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、脂类化合物、酮体、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰糖蛋白含量均高于血瘀证组，高密度脂蛋白、不饱和脂肪酸含量均低于血瘀证组，提示两组在脂代谢、糖代谢均存在紊乱，且痰浊组程度更重。

2.1.2 气相色谱-质谱联用法

魏星和简维雄均采用气相色谱(GC)-质谱(MS)联用技术，以冠心病非血瘀证和健康人组为对照，探寻冠心病血瘀证血浆中的代谢标志物。魏星等[27]研究发现L-缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-丝氨酸能将冠心病与健康组分离开，且含量较健康组降低；在区分血瘀证组与非血瘀证组时，胆固醇、木糖醇含量有差异，还有包括L-缬氨酸、丙氨酸、花生四烯酸等44种物质对分类有贡献。这提示脂质代谢紊乱可能是CHD血瘀证的代谢特征之一。简维雄等[28]对CHD患者血浆进行检测发现，血浆中脯氨酸、亚油酸含量在CHD非血瘀证组水平下降，血瘀证组上升，由此推断脯氨酸、亚油酸含量可能是区分CHD是否为血瘀证的物质，但并非能区别CHD与健康组。同时，葡萄糖在血瘀证组表现为含量显著升高，与健康组比差异无统计学意义，在非血瘀证组表现为含量下降，与健康组比无统计学差异。本研究最终确定花生四烯酸、硬脂酸、乳酸、尿素、柠檬酸、β-羟基丁酸、油酸、葡萄糖、丙氨酸为CHD心血瘀阻证血浆代谢产物谱。这提示能量 (脂肪、葡萄糖)代谢紊乱与CHD心血瘀阻证有密切联系。周耀中等[29]运用超高效液相色谱/质谱(UHPLC/MS)联用的方法探究心绞痛血瘀证血清学特点，发现血瘀证患者血清中柠檬酸含量减少,肉毒碱、组氨酸、黄嘌呤含量增多(VIP>1且P<0.01)，柠檬酸、肉毒碱、组氨酸、黄嘌呤为内源性代谢标志物，涉及能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢、嘌呤分解代谢多个环节。赵琳琳等[30]在前期冠心病患者对比健康人血清的代谢组学研究的基础上，筛选出CHD血瘀证的潜在特异性标志物：胆碱、β-葡萄糖、α-葡萄糖和酪氨酸。杨小芳等[31]探究了冠心病气虚血瘀证和气滞血瘀证患者血清代谢组学的特点，发现组氨酸及瓜氨酸为二者的差异物,且在气虚血瘀证升高的更为明显。

2.2 尿液代谢组学研究

2.2.1 核磁共振法

张红栓等[32]采用核磁共振法对冠心病患者尿液进行检测，发现CHD痰浊证组尿液中柠檬酸、α-酮戊二酸、顺式-乌头酸、葡萄糖、3-羟基丁酸、丙酮、酪氨酸、肌酐、氧化三甲胺、二甲胺、马尿酸的含量高于血瘀证组。王娟等[33]在对CHD尿液代谢组学的研究中发现脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、葡萄糖、缬氨酸、组氨酸、马尿酸等物质的含量在CHD血瘀证组患者尿液中升高，而柠檬酸、肌酸酐、牛磺酸等物质的含量下降。这提示冠心病除存在脂质、能量代谢紊乱外，还可能存在肝肾功能损伤，脯氨酸可能是CHD血瘀证的生物学基础。

2.2.2 气相色谱-质谱联用法

简维雄等[34]对CHD患者尿液进行代谢产物鉴定，发现葡萄糖、甘油、木糖醇、马尿酸、油酸酰胺、丙酮为CHD心血瘀阻证尿液生物代谢产物谱，亦推断出心血瘀阻证代谢途径可能涉及糖、脂肪、蛋白质三大物质代谢，肝肾损伤亦可存在于其中。李静等[35]对CHD血瘀证大鼠尿液代谢组学的研究中亦发现冠心病血瘀证的病理机制涉及层面广，以能量代谢失衡，基酸代谢、糖代谢、嘌呤代谢紊乱及脂质堆积为主。

3 冠心病血瘀证蛋白质组学研究

3.1 表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术

姚笛等[36]采用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术对冠心病急性心肌梗死患者血清进行蛋白质组学的检测，并以正常人群为对照，研究在冠心病与正常组中找到29个差异蛋白峰，其中M/Z 1 562.79等9个差异蛋白峰在冠心病组中呈高表达，M/Z 1 501.44等20个差异蛋白峰在冠心病组中呈低表达，M/Z 4 649.81和M/Z 9 536.92两个差异蛋白峰组成的生物标记物能够将冠心病组和正常对照组很好地区分；在冠心病痰瘀证组和血瘀证组中找到35个差异蛋白峰，M/Z 1 986.37等12个差异蛋白峰在痰瘀组和血瘀组中呈高表达；M/Z 4 980.48等8个差异蛋白峰在痰瘀组和血瘀组中呈低表达；另有M/Z2 242.14等15个差异蛋白峰在痰瘀组中呈高表达，在血瘀组中呈低表达。M/Z 8 654.96、M/Z 2 081.65、M/Z 18 667.3和M/Z 2 242.14四个差异蛋白峰组成的生物标记物能将痰瘀组和血瘀组样本很好地区分。并用决策树的方法建立了冠心病和冠心病痰瘀证血清蛋白预测模型。

3.2 同位素标记相对和绝对定量技术

肖隋熙等[37]用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对冠心病血瘀证和非血瘀证患者血清进行分离，鉴定得到780个蛋白质，有27个蛋白质点在两组中有差异，其中11个涉及免疫反应、细胞间粘附作用(血小板参与的凝血反应、脂质代谢上调)的蛋白质点上调,16个涉及血小板细胞变形、细胞与细胞间关系迁移、细胞损伤表达下调的蛋白质点下调。刘烨[38]研究发现冠心病血瘀证患者与健康人之间有12个蛋白质点。

3.3 双向凝胶电泳联合质谱技术

周倩倩等[39]研究找到冠心病血瘀证患者和健康人组之间血清6种差异蛋白质：视黄醇结合蛋白4(RBP4)、载脂蛋白E(ApoE)、载脂蛋白A1(ApoA1)、CD5抗原样蛋白(CD5L)、结合珠蛋白(Hp)、血清白蛋白(ALB)，推测上述蛋白质可能与CHD血瘀证有关。

3.4 高解析离子淌度质谱(HDMS)与纳升级超高效液相色谱(UPLC)联用技术

赵慧辉等[40]采用高解析离子淌度质谱(HDMS)与纳升级超高效液相色谱(UPLC)联用的方法，并去除冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者和健康人血浆中6种丰度最高的蛋白后对冠心病不稳定性心绞痛血浆进行进行无标记定量蛋白质组分析找到总蛋白数3 843种，差异蛋白数25种,上调蛋白数13种(Haptoglobin、SAA、CP、C6、MYH11、APOH和ANXA6，及心绞痛血瘀证患者独有蛋白3种，ACTA1、ITIH3和LBP),下调蛋白数12种(HBB、HBA、HBE、HBD、HBG、HRG、IGHG、GSN和TF)。

4 结语与展望

中医药作为中华民族的瑰宝，辨证论治贯穿于整个疾病的诊治过程，传统的中医学在继承先人经验的基础上辨证论治存在较大的主观性，在精准医疗的时代，如何使辨证更加精确、客观是目前亟待解决的问题。冠心病的诊断金标准是造影检查，其有创性和副作用限制了冠心病早期筛查，不能很好地区分稳定性与不稳定性心绞痛。基因组学、蛋白质组学和代谢组学具备动态性、整体性、系统性的特点，作为新的桥梁，将病与证相结合，更好的为中医病证结合、辨证论治提供客观化证据，推动中医药走向世界。目前基于三大组学的冠心病血瘀证的研究揭示了冠心病血瘀证患者在凝血、炎症因子、脂质、糖类、氨基酸及能量代谢方面存在相应的变化，且代谢紊乱往往是多方面的，揭示了其机理的复杂性。

目前对冠心病中医证候组学特点的研究中，存在样本量小、单中心、病程不一等问题，中医证候诊断影响纳入分组，继而影响组学的结果，中医证候诊断标准规范化也是目前亟待解决的问题之一。三大组学的检测受到年龄、性别、饮食等环境的影响，筛选出的生物标志物关系、作用通路及机制需要进一步研究，这有助于为探究药物治疗作用机制及寻找药物靶点提供依据。在研究过程中，组学提供的数据量较大，如何有效地分析这些海量数据仍是组学研究中的难点[41]。目前冠心病血瘀证的组学研究多基于病证结合，无法排除疾病本身对生物标志物的影响。因此基于组学技术的冠心病血瘀证研究需要横向与纵向相结合，既要对血瘀证在冠心病中的组学特点研究，又要对血瘀证在其他疾病中的组学特点进行研究，这可能更符合中医学异病同治、同病异治的治病原则。