奥沙利铂通过调控P53、miR-34a抑制胃癌细胞的增殖*

王鑫元，国 强，常哲瀚，4，曹晓宇

(1.内蒙古科技大学包头医学院2018级在读研究生，内蒙古 包头 014040；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院；3.内蒙古科技大学包头医学院2019级在读研究生；4.内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室)

胃癌是我国发病率与死亡率居前5位的消化道恶性肿瘤之一[1]，研究表明其发病率为70/10万[2]。目前胃癌根治术联合新辅助化疗是最主要的治疗手段，且此治疗方法相对成熟[3]，能够提高胃癌患者的五年生存率。但部分前往医院就诊的患者已处于进展期或伴有淋巴结转移和远处转移，错失了最佳手术时间，所以全身化疗药物治疗是中晚期胃癌的主要治疗手段[4]。奥沙利铂是近年投入临床使用的第3代铂类药物，可与DNA相结合，具有广谱的抗癌活性，且与第二代铂类药物无交叉耐药的情况出现，其血液学毒性、胃肠道和肝肾功能的副作用低于第二代，出现周围神经炎的患者在停药后也可逐渐恢复[5-6]。

P53是人体内最常见的抑癌基因，也是近些年研究最广泛的基因之一。P53蛋白可诱导细胞周期阻滞，在下一个周期起到修复DNA的作用，抑制肿瘤细胞的发生发展[7]。microRNA(微小RNA，miRNA)是一类存在于真核生物中通过降解靶信使RNA来调控的小分子RNA，其表达影响胃癌的淋巴结转移[8]。miR-34a是miR-34家族的一员，其阳性表达与患者的淋巴结转移和TNM分期相关[9]。miRNA作为P53的下游靶基因，可诱导细胞凋亡，引起细胞周期阻滞，从而抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭[10]。本研究构建胃癌细胞的加药模型和转染过表达miR-34a模型，Western blot和Real-time PCR技术探究P53、miR-34a两者之间的关系，明确奥沙利铂对P53和miR-34a在胃癌细胞中的表达，为中晚期胃癌的治疗提供新的方案与临床治疗思路。

1 材料与方法

1.1材料 BGC-823细胞购自于中国科学院上海细胞生物研究所，RPMI Medium 1640培养基、胰蛋白酶(0.25 %)、PBS缓冲液、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶抑制剂(PMSF)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL Plus超敏发光液、4×蛋白上样缓冲液(含DTT)、10×电泳缓冲液、10×TBST缓冲液均购自于北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清(Fetal Bovine Serum)购自于杭州四季青生物工程材料有限公司，注射用奥沙利铂购自于江苏恒瑞医药股份有限公司，Opti-MEM®I Reduced Serum Medium、Lipofectamine 2000均购自于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)购自于大连美仑生物技术有限公司，M221 Direct-load Color Prestained Protein Marker购自于北京康润诚业生物科技有限公司，兔单克隆P53 抗体(#9282)、兔单克隆β-actin (13E5)抗体(#4970)均购自于Cell Signaling Technology公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗购自于北京中杉金桥生物技术有限公司，RNA抽提试剂盒、miRNA荧光定量PCR试剂盒购自于上海吉玛基因有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 用含10 % FBS的 RPMI Medium 1640培养基，加入青霉素(100 U/mL)、链霉素(1 mg/mL)，在37 ℃、5 % CO2的细胞培养箱中在100 mm培养皿中常规培养胃癌BGC-823细胞，显微镜下观察细胞密度达85 %～90 %进行细胞传代，每盘按照1∶2的比例进行分盘接种。

1.2.2细胞加药 在37 ℃、5 % CO2的细胞培养箱中常规培养，显微镜下观察细胞密度达80 %左右加入终浓度为13 μg/cm2的注射用奥沙利铂，放入培养箱中继续常规培养12 h、24 h，分别记为12 h组和24 h组。

1.2.3细胞转染 将细胞种植在96孔板中常规过夜培养，分别在不含血清的25 μL Opti-MEM培养基中稀释5 pmol的miR-34a和空载荧光质粒。取25 μL不含血清的Opti-MEM培养基中加入0.5 μL Lipofectamine 2000，混匀后室温孵育5 min。将稀释后的miR-34a、NC荧光质粒与稀释后的Lipofectamine 2000混合，混匀后室温孵育5 min。弃掉96孔板中的原培养基加入混合液放入培养箱中孵育24～48 h，并在荧光倒置显微镜下观察。将转染成功的细胞分别记为+34a组与NC组。

1.2.4CCK-8检测细胞活力 制备细胞悬液接种在96孔板中，每孔加入100 μL培养基，在37 ℃、5 % CO2的细胞培养箱中培养至细胞贴壁。向孔内加入浓度为13 μg/cm2的注射用奥沙利铂，并设置一个空白孔，分别培养12 h、24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，在加完试剂后轻轻敲击培养板充分混匀，在培养箱中37 ℃恒温培养2 h后，在波长为490 nm下分别检测各孔吸光度值，并计算细胞活力。C组正常培养细胞，未做任何处理。

1.2.5Western blot检测蛋白表达 收集各组细胞并提取细胞总蛋白。使用BCA试剂盒测量蛋白液浓度，使用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒分别配置10 %的分离胶与5 %的浓缩胶，按照上样体积上样,进行电泳分离并电转印到PVDF膜上并过夜转膜，5 %脱脂牛奶进行封闭。使用一抗(P53、β-actin)按照1∶1 000稀释后在4 ℃摇床孵育过夜。对应二抗按照1∶1 000稀释后在室温孵育2 h，使用ECL超敏发光液并在化学发光仪检测蛋白信号。

1.2.6Real-time PCR检测m RNA表达 收集各组细胞并提取细胞总RNA。使用Nano Drop2000检测各组RNA浓度，应用Hairpin-itTM MicroRNAs Quantitation PCR反转录试剂盒将microRNA反转录为cDNA并进行实时荧光定量PCR检测miR-34a的表达情况。使用通用反转录试剂盒将P53 mRNA反转录为cDNA，使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix检测P53 mRNA的表达情况，使用2ˉΔΔCT计算基因相对表达量。

表1 real time引物序列

2 结果

2.1奥沙利铂对BGC-823细胞活力的影响 CCK-8结果显示，与C组相比，加药浓度13 μg/cm2的12 h组与24 h组细胞活力均呈下降趋势(P<0.05)，24 h组比12 h组细胞活力下降更显著(P<0.05)。NC组与C组相比差异无统计学意义(P>0.05)，+34a组细胞活力较C组表达下调(P<0.05)。见图1。

2.2奥沙利铂及过表达miR-34a对BGC-823细胞P53 mRNA表达水平的影响 P53 mRNA的表达水平在12 h无明显变化，与C组相比差异无统计学意义(P>0.05)，24 h P53 mRNA表达上调(P<0.05)。NC组P53 mRNA的表达水平增加，但与C组相比差异无统计学意义(P>0.05)，+34a组较C组表达上调(P<0.05)。见图2。

2.3奥沙利铂及过表达miR-34a对BGC-823细胞P53蛋白表达水平的影响 P53的蛋白表达水平在加药12 h与C组相比差异无统计学意义(P>0.05)，24 h P53表达上调(P<0.05)。NC组与C组相比差异无统计学意义(P>0.05)，过表达34a组P53蛋白表达量较C组表达呈上升趋势(P<0.05)。

3 讨论

胃癌是我国发病率最高的消化道恶性肿瘤，并且患者的预后较差，早期诊断与治疗能够显著改善患者预后并提高患者的5年生存率[11]。奥沙利铂作为第3代铂类药物，具有较高的抗肿瘤活性，许多基础研究与临床试验已充分证明单用或与其他药物联合应用均有明显的疗效[12-13]。目前临床上使用的化疗方案有XELOX、FOLFOX等。CCK-8实验结果提示，在加入13 μg/cm2的奥沙利铂后12 h和24 h，胃癌细胞BGC-823活力明显受到抑制，本结果与之前相关研究相符[14]。

miRNA是一类非编码的小分子单链RNA，长度一般在19～24 nt，多由单链RNA的前体经过加工后生成[15]。miR-34a不仅与胃癌的发生有关，而且与胃癌的增殖、进展、侵袭及远处转移密切相关[16]。我们的结果表明，过表达miR-34a组的胃癌细胞BGC-823与C组和NC组相比细胞活力呈下降趋势。

P53是公认的抑癌基因，位于人体内染色体17p13位置处。野生型P53参与DNA的修复，抑制癌细胞的增殖，促进凋亡，影响细胞周期、血管形成等有关[17]。结果显示，在加入奥沙利铂24 h后，胃癌细胞BGC-823的P53 mRNA和P53蛋白表达呈上调趋势，表明在加入奥沙利铂后能够上调P53的表达，从而起到抑制胃癌细胞的增殖、发展，降低细胞活力的作用。有研究研究表明，P53能够诱导多种microRNA的表达，其中P53对于诱导miR-34a的作用最明显[18]。miR-34a可诱导P53表达上调，起到促进肿瘤细胞凋亡，抑制其发展的作用[19]。我们发现，过表达miR-34a组的P53在mRNA表达量和蛋白表达量均表达上调，表明过表达miR-34a作为P53的下游靶基因，可诱导P53的表达上调，与上述研究结论相符。

综上所述，奥沙利铂可能通过激活miR-34a，诱导上游的P53基因表达，起到促进胃癌细胞BGC-823凋亡、减缓肿瘤的浸润与淋巴结及远处转移，以有效地增加中晚期患者的五年存活率，为奥沙利铂治疗中晚期胃癌的患者提供新的治疗方案，并为相关耐药机理的研究提供新的研究思路。