实时荧光定量PCR法在手足口病中的诊断价值

李文瑞 叶敏南 何月敬 梁健行 吕 芬 黎四平 张耀忠

1.广东医科大学附属东莞儿童医院检验科，广东东莞 523320；2.广东省东莞市儿科研究所，广东东莞 523320

手足口病在医学上较为多发，它主要是由肠道病毒感染而导致的传染性疾病，近年来的临床调查发现此病症已成为儿童的常见疾病之一[1-2]，发病时间主要集中在春夏季，尤其是男童的数量明显多于女童，但年龄越大的儿童，发病会越少[3]。其临床症状主要表现为厌食、低热、口腔、手部及足部出现小溃疡，大部分儿童在患有手足口病后会自行康复，但也有少部分儿童的病情会进一步加重而引发肺水肿和心肌炎等并发症，严重时还有可能导致儿童死亡[4-5]。临床对手足口病的诊断依靠已经出现疾病或症状来判断，症状不明显时会导致漏诊，影响治疗，因此选择一种安全有效的方式对其进行诊断，对于儿童的康复来说极为重要, QPCR 检测是临床上常见的一种检测方法，本研究采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测手足口病，评价其临床价值，现将实验结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年1—12 月我院手足口病儿童163 例作为本次研究的试验组，其中女72 例，男91 例，年龄13 d ～8 岁，平均（4.7±2.9）岁，该组患者均符合《儿科手足口病理学诊断规范》中相关病症的诊断标准[6]，其基本资料均完整登记。选取同期在我院体检的161 例儿童作为对照组，其中女74 例，男87例，年龄21 d～7岁，平均（5.2±1.7）岁。

纳入标准：①年龄在8 岁以下的儿童；②有手、口腔等出现疱疹且疑似手足口病的有关症状儿童；③完善肠道病毒PCR 相关检查的儿童。排除标准：①存在基础性疾病或严重精神障碍的儿童；②有其他病毒性感染儿童；③未完善肠道病毒PCR 相关检查的儿童。两组儿童一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 仪器与试剂

实时荧光定量PCR 检测采用ABI7500 荧光定量PCR 仪（美国赛默飞）对CoxA16、EV、EV71 进行检测，扩增反应条件：40℃ 25 min，1 个循环；94℃ 3 min，1 个循环；93℃ 15 s，55℃ 45 s，40 个循环。试剂采用中山大学达安基因股份有限公司原装试剂。

1.3 方法

标本采集：采集儿童粪便标本6 ～9 g，立即放入专用采便管内，0 ℃冰壶保存，30 min 内送检。核酸提取及检测等所有操作均说明书进行，操作人员都取得相应资格证。阳性结果需同时满足下列3项：①阴性质控品。无典型S 型扩增曲线或无Ct 值；②阳性质控品。呈典型S 型扩增曲线且Ct ≤30；③检测样本结果呈S 型扩增曲线且Ct 值≤34.9。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0 对实验数据进行分析处理，计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，计量资料用（）表示，采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

试验组163 例儿童中实时荧光定量PCR 检测阳性144 例，其中女61 例，男83 例，阳性为144 例（88.34%），对照组161 例儿童中阳性3 例，阳性为3 例（1.86%），两组比较差异有统计学意义（χ2=21.873，P=0.000 ＜0.05）。对 照 组144 例 手足口病患儿中主要以肠道病毒EV 为主，有102 例（70.83%），其次是CA16，有33 例（22.92%），最后是EV71，有9 例（6.25%）。

3 讨论

手足口病是由于肠道病毒感染而导致起的儿童传染病，潜伏期大约为1 周左右[7-8]，其发病时间分布较为广泛，并且不存在明显的地区性，每年的春夏秋冬均有发病的可能，但在我国以夏秋季为高发季节，在疾病的爆发期间，托儿所及幼儿园呈现集体感染，其具有极强的传染性，主要通过患者的咽喉分泌物、疱疹液、唾液、粪便进行传播，能够在短时间内形成较大的规模流行[9]。我国目前出现手足口病的儿童年龄通常在5 岁以下并且以男童为主[10]，而大部分儿童的发病时间都在每年的5—10 月，儿童的发病持续时间通常在2 ～7 d，尤其是2 ～4 岁的儿童发病率最高，随着儿童年龄的增长，发病率会逐渐降低[11]。有文献报道肠道病毒中的EV71 病毒感染儿童，随着其感染症状的不断发展，会出现较为明显的神经系统并发症[12-13]，具有较大的危害性以及致死率。

QPCR 技术是核酸检测中常用方法，这种技术不仅具有普通PCR 的高灵敏性，并且在检验过程中将荧光探针应用于其中，同时具有DNA 杂交的高特异性和光谱技术的高精确性[14]，检测过程中总时长大约2.5 h，加快了检测时间，对于手足口病患者的确诊及治疗提供了相应的证据，也为患者后续的治疗工作开展提供了参考依据[15]。在本研究结果中显示试验组163 例儿童中QPCR 检测阳性144 例，阳性率为88.34%，对照组161 例儿童中阳性3 例，阳性率1.86%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），对照组有3 例阳性可能是症状不明显的手足口病。我们研究还发现，手足口患者中主要以肠道病毒EV 为主，有102 例（70.83%）。因此将QPCR 检测方案应用于手足口病的检测中，患儿的诊断阳性率与实验室病理检查结果无明显差异。

综上所述，实时荧光定量PCR 对手足口病的早期诊断有较高的临床价值，对于后续的治疗工作有积极意义，值得临床上推广使用。