创新性皮肤局部外用药物研发分析及对皮肤药代动力学的影响研究

黄雪梅 高 强

1.广东百澳药业有限公司，广东开平 529339；2. 纽斯葆广赛 （广东）生物科技股份有限公司，广东广州 510931

皮肤药代动力学是研究皮肤外用药物及其代谢物在皮肤上的分布、吸收、消退和代谢的科学，在皮肤外用药物研究和评价方面有重要意义。然而，对皮肤药代动力学在评价外用药物的安全性、有效性和重要性方面的认识不足，对皮肤药代动力学研究技术的发展缺乏深刻的理解[1-2]。由于技术或需要侵入性方法等方面产生的困难，减少了皮肤药代动力学研究。这一状况严重影响了新型皮肤外用药的发展和评价。从皮肤药代动力学研究的主要内容和作用出发，阐述可供选择的检测技术和方法及其优缺点[3]，遂本文以创新性皮肤局部外用药物研发分析及对皮肤药代动力学的影响研究为题，报道如下，希望能对这类药物的研发和评价提供有价值的参考。

1 研发现状与研究的必要性

1.1 研究现状及存在问题

皮肤药代动力学用来评估局部药物，其药代动力学方法与口服药相似，但不同之处在于局部皮肤药代动力学研究是测定药物在皮肤中的浓度，而不是血浆中的浓度。而口服药物的药代动力学试验则不需要这一步骤[4]。由于皮肤局部药代动力学的开发是皮肤药物浓度测定，因此，局部皮肤采样法已成为局部药代动力学研究的热点，不同于其他方法。目前国内具有研发实力的申报单位尝试用体外皮肤透皮吸收试验或全身药代动力学试验代替皮肤局部药代动力学研究，但存在很大局限性。由于体外皮肤与体内皮肤之间缺乏主动的转运过程，体外皮肤未完全反映出药物在体内的实际过程[5]；而另一方面，随着时间的延长，体外皮肤的生理状态状况越来越差，导致转运过程缺乏主动法，影响皮肤药物的吸收、分配、消除。因全身药代力学测试药物吸收后的血药浓度，可分析药物对人体可能产生的毒性反应；但是没有证明药物是否能到达治疗的靶点，药量是否对该部位有治疗作用，药物是否顺利到达该部位，很难判断其是否对皮肤靶标有作用[6]。因此，上述方法不能用来评价局部皮肤用药的效果。由于我国皮肤药代动力学研究不足、不科学或不充分等问题，严重影响了其评价、应用效果与研发，因而无法开展下一步的实验研究。鉴于临床试验的进展，药物本身可能无法达到治疗目的，或药物使用部位或达到部位的浓度不足以发挥治疗作用，从而难以保证其疗效[7]。

1.2 局部药品开发的战略意义

局部性药物作用局限于皮肤。因此必须在皮肤中有足够浓度的药物，以便在一定的时间内达到最佳的药效。在吸收不良或药物不能到达皮肤受损部位时，药物迅速从皮肤排出，药物本身在皮肤上药理活性很低时，会影响药物的局部疗效，根据具体配方、浓度和剂量，皮肤药代动力学测试应指导皮肤产品渗入人体皮肤或皮肤表层组织[8-9]；或其他有效标记表明，在人体皮肤和浅表皮肤组织中有足够的药物可达到并维持足够的剂量。局部皮肤是浸润腔的表皮，而血液系统是其排泄室，区别两种局部应用的类型。局部性生物利用度反映了活性成分达到作用部位（如皮肤）的速度和程度；而全身生物利用度可能不能完全反映治疗局部性皮肤病所需药物的皮肤生物利用度；但是，这对于评价体内负荷毒性和经皮吸收系统有重要意义，需要对外用药物的生物利用度进行综合评价[10]。

2 国内常用的皮肤药代动力学试验方法

我国皮肤药代动力学检测方法主要有体外皮肤透皮吸收检测和全身药代动力学检测。其限制因素主要是离体的皮肤之透皮吸收的试验，因为离体皮缺乏主动转运过程，与在体皮有较大差异，所以无法对体内药物的真实过程作出充分的反应[11]；另一方面，皮肤的吸收、分布和消除，在体外随时间延长，与人体内皮肤的生理状态相距甚远，导致长期缺乏监测皮肤内产品的吸收、分布和消除过程。在检测到全身血药浓度的局部吸收后，药物分析可能对人体产生毒性作用，但无法提供药物达到治疗目的的途径[12]。也无法提供该部位的药物浓度，无法确定其是否能起到治疗作用，这一部位的药物代谢状况也不能确定，因此很难评价它是否能够作用于皮肤靶区。皮肤药代动力学试验应揭示在特定剂型、浓度和剂量下皮药渗入皮肤或表皮组织的现象；或者其他有效标志表明，在足够的时间到达和维持皮肤和浅层皮肤组织的皮药数量充足[13]。

3 国外的皮肤药代动力学试验

3.1 有创性新技术

①穿刺活检，用直径为2 ～10 mm 的一次性圆刀对表皮、真皮和部分皮下组织进行穿刺活组织检查[14]。②刮除术，通常使用安全刀对组织进行刮取活检，所获皮肤为浅层，包括表皮和部分真皮。刮除术通常用来在浅表皮肤上获取表皮角质层，但是，表皮深层的标本用更强有力的刮除术采集。少数试样的表皮是用快干的氰基丙烯酸酯胶粘剂制成。胶粘剂涂于玻片上，压至皮肤表面，经胶粘剂聚合后取出[15]。③负压吸泡技术，一般用来评价全身给药后皮肤中药物浓度。表皮设有多个小孔，利用真空装置抽气，使表皮产生水泡。空泡组分与间质液组分相似。此类方法能从不同皮肤部位获得组织，因此可根据不同适应证观察局部药物代谢[16]。这其中大部分是直接获得皮肤组织的方法，都是有创的方法。健康受试者很难被选择，所以很难进行实验。但刮宫活检、皮肤刮宫术和皮肤表面活检等技术在皮肤病的诊断和治疗中应用较多。所以用这些技术研究患者的药代动力学非常有必要。

3.2 非创伤性新技术

近年来，除了上述的侵入性技术外，一些非侵入性技术如成像技术也被应用到皮肤上[17]。激光扫描共聚焦显微镜和Roman 共聚焦显微镜似乎是一种很有前途的光学方法。这些新技术使用绝对非侵入性的方法将光束聚焦在皮肤中给定的深度，并在该水平上测量局部应用的化合物的浓度。目前，这些新技术和新方法已经在我国一些高校和科研院所得到应用。相信这些新技术和新方法可以为当前和未来的皮肤药代动力学无创研究提供良好的技术支持[18]。

4 其他方法

4.1 皮肤贴片法

皮肤贴片法也被称为皮肤药代动力学方法，此方法可用于相对无创性地评估摄入人体表皮的药物量。在用药后的不同时间间隔内，也可以使用涂上角质层的贴片来定量检测药物清除皮肤的过程。如胶带剥离是一种逐层去除表皮的技术。连续地贴在皮肤的相同部位，然后剥去。Konganti 等[19]研究采用20 片（使用TESA 标准技术可去除66%的表皮，需50 片左右）。需要贴上100 块皮肤表皮才能除去全部表皮。以前用在皮肤上的物质可以用胶带去除，用适当的分析方法，如HPLC 法、光谱法、闪烁计数法等进行定量。各种模式下，胶带剥离技术可用于无创性的透皮渗透性评价，在局部用药的皮肤药代动力学研究中具有很高的潜在价值，在健康人体的药代动力学研究中也经常使用。然而由于不同的皮肤病有不同的累及部位，不同的皮肤部位需要药物到达，而不仅仅是角质层，因此用这种方法来评价局部皮肤的药代动力学特征并不全面。如体癣、脚癣、手癣、足癣等浅表真菌感染通常涉及角质层，皮肤发炎和湿疹多为浅表皮肤病，银屑病不仅包括表皮，还包括皮炎；痤疮累及毛囊、皮脂腺。对不同的适应证，应根据所涉病灶的不同情况，采用不同的方法进行药动学测试，观察药物是否到达病灶，确定药物在病灶上的浓度是否足以起到治疗作用。这就需要更多的技术和测试方法来支持相关的研究[20]。

4.2 皮肤微透析（DMD）

DMD 是一种微创体内取样技术，通常是将探针透析液持续流动，并保持浓度梯度定时采集透析液，并将适当的分析设备和技术应用于特定部位，以与皮肤表面平行放置并具有透析作用的探针透析液，测定内外源小分子或亲水化合物在真皮间液和皮下组织中的游离浓度。近年来，随着其方法学的不断发展，该技术已广泛用于评估皮肤局部制剂，离子电渗药物转运，皮肤转运相障碍[21]。与其他方法相比，DMD 具有体内实时原位采样，在线检测等突出特点，可以在目标部位获得药物及其代谢物的游离浓度[22]。局部药物转运的直接相关数据是获得皮肤靶向的局部皮肤准备工作体内研究数据的首选方法，可用于正常皮肤，屏障功能不全皮肤和皮肤病变，也可用于研究深层皮肤中的药物浓度。但DMD 技术对于水溶性低和易与蛋白质结合的物质，常要求优化灌流液以提高探针的低回收率，这限制了它的应用，在如何改进方法的重现性、如何更方便地植入探针和由此导致的组织损伤之间的确切关系，以及如何更简便地应用DMD 方法获得的数据，这方面还需要进行深入研究。与皮肤药代动力学方法相比，DMD 方法具有更大的侵入性，对脂溶性更高的，而对预期在角质层中起效的物质（如皮肤药代动力学法）而言，其他方法往往更适用[23]。

4.3 开流微量灌注（OFM）

OFM 是近几年发展起来的一种低侵入性、持续性、无膜采样技术[23]，OFM 是一种对微透析技术的改进，以肉眼可见的钢网代替微透析探针的透析膜，由于该系统在对组织间液交换过程中是开放的，可以对内外源物质进行采样，而不受分子量、蛋白质结合率和脂溶性等因素的限制，适用范围更广，现已获得欧洲CE 认证的皮肤微灌注（dermal OFM，dOFM）装置是一种线性设计的探针，0.5 mm的插头，以及采用推挽式的可穿戴泵，通过高频超声扫描可确定探针的植入深度（50 MHz）。Heyman等[24]研究了5%阿昔洛韦乳膏的生物利用度和生物等价值，20 名健康受试者随机选择局部外用阿昔洛韦乳膏6 个部位，分别植入两个探针，取样至36 h，对真皮内阿昔洛韦浓度的动态变化过程进行检测，实验结果[25]表明，阳性对照组（R/R）可获得稳定的生物等效值，阴性对照组（T/R）可获得不等效值，表明dOFM 可敏感地表征真皮内阿昔洛韦浓度的生物利用程度，可作为生物等效值评价的一种方法[26]。

4.4 体外（表）研发

单一药制剂体外生物等效性研究以局部制剂的体外特性为目标，FDA 已开始批准对局部制剂的单一制剂（非溶液剂）的体外研究，包括离体试验（制剂的理化性质）和离体试验（IVRT）[27]，尽管作为质量控制程序，局部性制剂中有效成分的体外释放试验可以证明局部性制剂成品的性能特征，并证明在扩大和批准后改变用途的理由，但美国FDA 在2013 年发布了关于阿昔洛韦软膏的研究草案[28]，其中规定，阿昔洛韦软膏在采用体外方法进行生物等效性研究时，必须满足下列条件：受试剂和指定的参考制剂具有相同的定性和定量成分（Q1/Q2），物理化学特性（Q3），且两种制剂的体外释放试验结果一致。垂向扩散池被认为是确定外用制剂中有效成分从制剂中释放的速度和预测药物生物利用/生物等效性的最有效的体外模型美国FDA 目前支持对使用合成膜的药物体外释放度的研究，因为合成膜有充足的资金，能够消除因年龄、种族、性别、解剖部位等不同而产生的差异，从而可获得重复性更高的药物体外渗透数据[29]。有学者[30]对印度和南非四种阿昔洛韦普通乳膏和新制剂Zovirax 乳膏进行体外释放评价，其90%置信区间为75%～133%，有待进一步研究。

5 总结

综上所述，皮肤局部外用药物研究相对复杂，没有统一的标准方法可对其进行综合评估，在不同的方法中，国际监管者的接受程度不同，所以在研究时应根据其物理化学性质、疾病的靶点等选择合适的抽样技术或研究方法，或将多种方法结合使用，可更全面地了解皮肤病用药在作用目标部位的吸收、分布和代谢情况。以此为基础，结合全身吸收后的药代动力学特征，对局部用药进行体内药代动力学评价，为进一步临床试验提供理论支持。