蛋白质组学在口腔疾病生物标记物中的应用

高思宇，吴 佳，谢元栋，詹骆宁，胡 玲，李 毅*

(1.吉林大学口腔医院 儿童口腔科，吉林 长春130021；2.吉林大学 牙发育与颌骨重塑吉林省重点实验室，吉林 长春130021)

蛋白质组学技术是阐明蛋白质水平生物学过程的强有力工具，基于质谱分析(mass spectrometric analysis，MS)可对一组基因表达的所有蛋白质进行鉴定和检测，结合生物信息学和数据库等工具，可深入探索疾病发生发展机制。本文检索了蛋白质组学相关最新技术，并就蛋白质组学在探索口腔疾病生物标记物中的应用进行综述，为疾病的早期诊断和预防提供参考。

1 蛋白组学的定义和技术

蛋白质组学是1994年由Marc Wilkins首次提出，可对一组基因所表达的全部蛋白质进行分析检测，在功能基因组学的研究领域中作用显著。蛋白质组学具有高通量、高灵敏、可重复等优点，避免了mRNA因迅速降解和转录不当而引起误差，尤其是可对蛋白质翻译后修饰(posttranslational modifications,PTM)进行动态研究，有利于探索口腔疾病生物标记分子，主要技术包括：蛋白质分离富集、蛋白质定性定量分析、蛋白质相互作用分析[1]。

1.1 蛋白质分离与富集

生物样品成分高度复杂，高效的预处理可使结果精准。样品纯化首先需要溶解蛋白质，加入辅助添加剂可提高溶解度，传统的十二烷基硫酸钠(SDS)效果不佳，新型溶解剂氯化-1-十二烷基-3-甲基咪唑离子液体(C12Im-Cl)可高效促进蛋白质溶剂且具有易除去、酶相容性好、不干扰质谱分析的优点[2]。常用蛋白质分离技术包括色谱分析法、免疫亲和沉淀法和双向凝胶电泳技术(2-DE)，但色谱分析法中低浓度蛋白富集易受到高浓度掩盖，免疫亲和沉淀法需要高效的纯化抗体配伍[3]，2-DE技术难以分离极酸极碱或分子量过小过大的分子[4]。基于选择性沉淀多肽蛋白的非色谱技术逐渐兴起，该技术对蛋白富集尤其是翻译后修饰分子有显著提高[5]。二维荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)可利用荧光染料同时对多个预标记样本进行分析，现已逐渐取代2-DE。洗涤剂的性能对纯化效率影响显著，性能温和的洗涤剂可以在不影响目的蛋白纯化的条件下去除多余杂质。常用的SDS和尿素类属于强洗涤剂，易降低酶切、色谱分离和质谱检测的效率，十二烷基麦芽糖苷(DDM)作为新型温和洗涤剂，可在不影响酶活性的情况下增加蛋白溶解性，提高回收率，适用于微量蛋白的翻译后修饰纯化分析[6]。

1.2 蛋白质的定性定量

随着研究的需要和技术的提高，蛋白质组学的定性定量分析朝着高精准高覆盖方向发展。基于同位素稀释质谱原理的MS技术可对上千种蛋白质进行精准定性定量分析，现已是蛋白质组学研究的主导趋势。基于MS的蛋白质组学分析流程主要分为自下而上和自上而下：前者是在对样本的水解肽进行数据库匹配的定量分析，比如“鸟枪法”；后者是直接对完整蛋白质进行MS分析，例如基于软电离源方法的基质辅助激光解吸电离(MALDI)技术，通过产生单电荷离子将样品吸附于MALDI板后直接进行靶向肽成像分析，灵敏度高但并非绝对定量，适用于定位生物标记物[7]。靶向蛋白质组学是对“鸟枪法”的补充，首先合成一定数量稳定同位素标记的氨基酸标准肽，然后对标准肽和样品肽进行光谱峰值强度的比较，从而达到绝对定量，但由于标准肽的合成费时费力、软件特殊、适用范围局限而受到限制[8]。无标记同位素定量分析技术逐渐兴起，其原理是在蛋白分子进行光谱分析后对光谱信号强度或其校准曲线下面积值(AUC)进行统计，多用于对样品进行相对定量分析以研究分子信号网络通路[9]，适用范围广、操作简单但精准度较低，目前已有研究对其进行改良，改良方法的精准度足以代替标记定量法，例如蛋白丰度指数化(emPAI)、灰度绝对量化(iBAQ)、绝对蛋白表达量化(APEX)等[9-10]。

1.3 蛋白质相互作用分析

蛋白质分子通常是经过相互作用形成特定复合体以实现其生物功能，常见用于分析相互作用技术包括酵母双杂交、串联亲和纯化以及免疫共沉淀法等，但这些方法普遍存在通量低以及无法精准确定蛋白作用位点的缺点。化学交联结合质谱技术在精准确定蛋白质三维结构、蛋白质相互作用及其位点具有优势，具有速度快、通量高、成本低、范围广等优势[11]，与低温电镜技术结合后反映蛋白质分子间的构象动力学[12]。

2 蛋白质组学在探索口腔疾病的生物标记物中的应用

2.1 牙周炎

牙周炎的主要致病因素来自宿主(自身免疫反应)和细菌[1]，利用蛋白质组学对炎性反应和细菌代谢产物进行检测可用于寻找牙周炎相关生物标记物，牙周炎作为慢性病，相关病程的诊断至关重要。Choi[13]等利用MS首次在牙周炎患者龈沟液中发现天青素在牙周炎中表达上调，天青素与破骨分化抑制密切相关，可作为牙周炎骨修复程度的诊断指标。半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitor，CSTs)超家族分子已证实与牙周病关系密切，主要分为分泌型和胞内型，通过抑制半胱氨酸蛋白酶的水解作用从而发挥免疫防御和肿瘤抑制[14]，胱抑素C作为典型的分泌型蛋白分子，表达量与牙周炎严重程度成正相关[14]，而胱抑素B和胱抑素S与牙周炎成负相关，比较其家族分子表达高低可用于判断牙周炎进程[15]。蛋白质组学技术的一大优势是可以对蛋白质的PTM进行研究：D-核糖在参与牙周炎相关蛋白糖基化修饰时呈现出较高活性[16]；赖氨酸乙酰化作为P.G菌的常见代谢模式与牙周炎的P.G菌活跃度有关[17]。有效的筛查指标有助于准确诊断牙周炎病程，有研究者将蛋白质组学技术结合时间模式匹配和函数模拟进行纵向研究，对牙周炎生物标记分子进行筛选，推荐筛查指标包括天青素、溶菌酶C和肌球蛋白-9等[18]、钙结合蛋白S100A8和S100A9。

2.2 龋病

口腔环境的蛋白组成是影响龋病易感程度的重要因素，足量的防龋蛋白在维持矿化平衡、抑制致龋菌生长中具有关键作用，而防龋蛋白的表达缺失则意味着高龋率的发生。有学者利用iTRAQ/MRM联合技术对儿童唾液蛋白成分及其相互作用进行表征，构建了无龋、低龋和高龋患儿组的蛋白组学比较图谱，表达下调的关键蛋白包括S100A9、黏蛋白7、黏蛋白5B、富酪蛋白、富组蛋白1、胱抑素S、胱抑素SN以及富碱性脯氨酸涎蛋白(basic proline rich proteins，PRPs)，以上蛋白分子均被认为是防龋蛋白，表达量与龋病呈负相关[19-20]。牙体组织表面的获得性膜具有独特的微生态环境包括牙釉质表面获得性膜(acquired enamel pellicle，AEP)和牙本质表面获得性膜(acquired dentine pellicle，ADP)，其蛋白组成动态变化与龋病密切相关，Delecrode等分别将AEP和ADP暴露于致龋环境(酸性)并进行蛋白组学分析，AEP中CSTs超家族分子表达普遍增加，尤其是胱抑素B，该分子和羟基磷灰石之间具有良好亲和力可促进牙釉质再矿化[21]，而酸蚀后的ADP中则是黏蛋白表现突出，胱抑素B和黏蛋白的增加可能参与抑制脱矿[22]。

致龋菌蛋白表达与致龋率密切相关，蛋白组学研究结果发现：糖基转移酶(SMU_833)可促进变链菌产生突变抗菌素以抑制其他细菌增强自身抗氧化应激能力[23]；谷氨酸消旋酶(MurI)与变链菌生物活性密切相关[24]，SMU_833和MurI表达增高说明变链菌表达活跃。蛋白质组学技术可与物种间微阵列的联合应用可用来研究不同菌株之间的相互代谢作用以探索新的龋病生物标记物[25]。生物学数据库与排除法蛋白质组学分析(subtractive proteomics analysis)的联合应用在变链菌UA159中发现了13种致龋相关蛋白[26]。

2.3 口腔癌

蛋白质组学可用于研究口腔正常组织由癌前病损状态(oral premalignant lesions,OPLS)进展为癌变组织的差异蛋白表达，为探索癌变相关生物标记分子发挥了重要的作用[27]。Ralhan[28]等利用iTRAQ分别将正常组织与OPLS进行质谱对照比较发现Stratifin、YWHAZ 和异质核核糖核蛋白K(hnRNPK)在OPLS中表达明显上调，YWHAZ可直接与核磷蛋白1(NPM1)协同作用以支持细胞过度增殖；Stratifin属于14-3-3蛋白家族，其表达上调可促进YWHAZ的表达增高；hnRNPK作为一种RNA结合酶可直接促进基因转录翻译、环氧合酶-2(COX2)激活及P53降解，其作用与炎症和烟草相关早期口腔癌有关，另外，hnRNPK还促进了YWHAZ和Stratifin的表达；3个分子相互作用模式提示了炎症与癌症相关性，可作为早期判断OPLS的生物标记物候选分子。学者们利用蛋白组学技术陆续证实在OPLS组织中蛋白酶激活剂(proteosome activator，PA)同源物PA28a/b/g(2)、S100A7、CD44、S100P、CK10的高表达是口腔癌预后不良的潜在生物标记物，某些因子还大量表达在患者唾液中[29-31]。研究者通过体外细胞实验也有发现：正常角质细胞株和鳞癌细胞株主要存在5种差异蛋白：膜联蛋白A1(Annexin A1)、热休克蛋白27、白介素1受体拮抗剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂clade B5、磷蛋白1以及过氧化物歧化酶2，其差异表达可作为鉴定口腔鳞癌细胞株蛋白谱的初步判断指征[32]。翻译后修饰是重要的检测指标，癌细胞表面的糖蛋白与细胞转移和信号传导有关，Chen[33]等对角质形成细胞和口腔鳞癌细胞表面的N-聚糖进行糖蛋白质组学质谱分析，发现CD147是癌细胞的关键粘附分子。

2.4 唇腭裂

唇腭裂是常见的颅颌面畸形，临床修复难以保证效果，蛋白质组学技术的应用将有助于从分子水平研究唇腭裂生物标记分子，在孕期进行蛋白分子表达水平可预测唇腭裂的发生率，为早期临床预防治疗提供理论基础。有人[34]首次使用“猎枪法”检测正常儿童和唇腭裂患儿的蛋白质组分，经过GO分析发现血清中维生素A转运体—视黄醇转运蛋白4(RBP4)在患儿血清明显减少，提示唇腭裂与RBP4和维生素A早期水平有关；唾液蛋白中修复相关蛋白水平显著增加，包括肌动蛋白、胱抑素、角蛋白及真皮因子(dermokine)；此外，促进硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)合成的TGF-β3分子表达水平增高，以诱导CSPGs介导的腭部融合[35]。

3 总结和展望

蛋白质组学已成为现代生物医学研究的重要组成部分之一，利用该技术对牙周炎、龋病等口腔疾病生物标记分子进行筛查有助于疾病的诊断和防治。蛋白质组学技术可以分别对口腔组织、血液、唾液等蛋白分子进行检测，适用范围广，检测方式多样，结果精准。现阶段由于缺乏对质谱分析结果的精准控制和具体的校准参数，并且存在蛋白复合物复杂度高而难以对其相互作用进行分析等问题，目前在临床运用中仍受到限制。