宏基因组二代测序在非HIV重症肺孢子菌肺炎患者中的应用

梁艳 方婉娜 王天立 邹叶强

耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii，PJ)是一种机会感染性病原体，可引起致命性的肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia，PCP)。肺孢子菌感染多见于HIV感染、器官移植术后及长期应用激素治疗等免疫低下患者，也可在免疫力正常的机体内定植[1]。随着化疗药物、免疫抑制剂的广泛使用，非HIV患者肺孢子菌肺炎发病率呈现增高趋势。临床多以发热、干咳和进行性呼吸困难等为主要症状，严重者可导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，临床病死率高达30%～50%以上。所以及时诊断和启动PCP特异性治疗是降低病死率的关键。但PCP的早期病原学诊断存在困难，传统方法是将肺泡灌洗液(BALF)行特殊染色以查找肺孢子虫包囊或滋养体，其在检测时间、阳性率方面存在局限性，容易延误诊治。

宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)可以直接从临床标本中提取全部微生物的DNA和/或RNA进行测序，包括病毒、细菌、真菌、寄生虫[2]。mNGS 技术被广泛应用于感染性疾病的研究，在血液、脑脊液、BALF中提示出良好的诊断性能[3]。多数常规培养不易获得的寡养细菌、真菌、病毒等病原体可以通过mNGS检测从呼吸道标本中检出[4，5]。现将我院2020年6～12月收治于呼吸重症监护病房的4例非HIV感染重症PCP患者的临床资料报道如下，以进一步评估mNGS在临床工作中的应用价值。

1 病例资料

1.1 病例1男，72岁，既往有间质性肺炎、炎性肌病、2型糖尿病，泼尼松片口服2月余(30mg/d)、冠心病。因气促、发热3d入院。院外体温最高38.0℃，咳白痰，伴气促、乏力、心慌，当地医院肺部CT示双肺炎症，给予头孢克肟0.1g tid 口服抗感染治疗，患者症状加重遂入我科ICU。入科体格检查：T：38.3℃，P：118次/min，R：28次/min(无创呼吸机、ST模式)，BP：117/73mmHg。嗜睡，双肺呼吸音低，可闻及湿性啰音，血气示I型呼吸衰竭。血常规：白细胞：9.42×109/L，中性粒细胞：90%，淋巴细胞：0.26×109/L，血小板：201×109/L，PCT：12.1ng/ml，呼吸道九联检(军团菌、支原体、衣原体、立克次体、腺病毒;甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒IgM抗体)：阴性，人免疫缺陷病毒抗体测定(HIV抗体)：阴性，LDH：1603U/L，BNP：3207pg/ml，肌酐：84μmol/L，T细胞免疫：CD4：84个/μl。入院诊断：①重症肺炎、I型呼吸衰竭；②脓毒症；③间质性肺炎；④炎性肌病；⑤2型糖尿病。给予美罗培南(1g q8h静滴)联合莫西沙星(0.4g qd 静滴)广谱抗感染治疗。入院后第2天患者病情加重伴血压下降，给予有创呼吸机辅助通气。行床旁支气管镜并行右肺下叶支气管分泌物送细菌+真菌培养、BALF送mNGS。下呼吸道分泌物涂片示革兰氏阳性球菌(+)，3d后mNGS回报耶氏肺孢子菌感染，序列数为25613，支气管分泌物培养提示金黄色葡萄球菌，血培养阴性。遂调整抗菌药物为哌拉西林他唑巴坦(4.5g q8h静滴)、复方磺胺甲噁唑片(3片q6h 口服)、利奈唑胺(0.6g q12h静滴)联合抗感染。治疗3d后患者突发心脏骤停，家属放弃治疗并出院。

1.2 病例2男，70岁，既往有肾病综合征3个月，现口服泼尼松片50mg/d。因气促半月，加重1周入院。院外以活动后气促为主，偶有咳嗽、低热，具体体温不详，夜间可平卧。院外抗感染治疗后症状无缓解。近1周气促症状加重收入我科ICU。入科体格检查：T：37.8℃，P：107次/min，R：25次/min（无创呼吸机辅助，ST模式），BP：128/84mmHg。神清，双肺呼吸音粗，可闻及湿性啰音。动脉血气：PO2：44mmHg，PCO2：24.7mmHg。入院诊断：①重症肺炎（细菌?肺孢子菌肺炎?）、I型呼吸衰竭；②肾病综合征。给予莫西沙星（0.4g qd 静滴）、复方磺胺甲噁唑片（3片q6h口服）抗感染治疗。入院当天给予支气管镜检查，气道分泌物送细菌检查、BALF送mNGS。血常规：白细胞：13.25×109/L，中性粒细胞：92%，淋巴细胞：1.21×109/L，血小板：270×109/L，PCT：0.19ng/ml，IL-6：25.15pg/ml。呼吸道九联检：阴性，HIV抗体：阴性，LDH：586U/L，BNP：908pg/ml，肌酐：84μmol/L，T细胞免疫：CD4：56个/μl。G试验：87.8pg/ml，GM试验：阴性，2d后mNGS回报耶氏肺孢子菌感染，序列数为308。治疗上同时给予营养支持，护胃、泼尼松40mg/d，5d后患者气促症状缓解不明显，遂加用卡泊芬净（50mg qd 静滴）联合抗感染。治疗10d后患者症状好转出院，复查肺部CT病灶较前吸收。

1.3 病例3男，55岁，既往有肾病综合征、Ⅱ期膜性肾病史。因咳嗽1个月，气促、发热20余天由当地医院转入我科。体温以低热为主(＜38.5℃)，稍活动后气促明显，伴咳嗽，无胸痛。院前肺部CT示右下肺空洞性病变，当地医院考虑重症肺炎、脓毒症，先后给予莫西沙星、哌拉西林他唑巴坦、头孢哌酮舒巴坦+替加环素抗感染。入科体格检查:T:37.6℃，P:123次/min，R:22次/min(无创呼吸机辅助、ST模式)，BP:92/67mmHg。神清，双肺可闻及湿性啰音。入院诊断:①重症肺炎；②I型呼吸衰竭；③右下肺空洞性病变查因:曲霉?；④脓毒血症；⑤肾病综合征、Ⅱ期膜性肾病。入院后完善相关检查: HIV抗体:阴性，T细胞免疫:CD4:108个/μl。同时行支气管镜检查留取右下肺分泌物送细菌、真菌培养，留取BALF送检mNGS。经验性给予头孢哌酮舒巴坦(3g q8h 静滴)联合替加环素(50mg q12h 静滴)。BALF送mNGS结果回报示耶氏肺孢子菌感染，序列数为1749，CMV病毒序列数为969。停用替加环素，给予复方磺胺甲噁唑片(3片q6h 口服)、卡泊芬净(50mg qd 静滴)抗肺孢子菌治疗。12d后，患者气促、咳嗽较前好转，出院后继续口服复方磺胺甲噁唑片巩固治疗，复查肺部CT病灶吸收好转。

1.4 病例4男，62岁，既往有慢性淋巴细胞白血病病史及R-FC化疗史。因发热6d并气促转入我科ICU。院外肺部CT示双肺磨玻璃样改变，体温最高39.5℃。当地医院给予头孢他啶、莫西沙星、氟康唑抗感染治疗。入科体格检查：T：38.3℃，P：115次/min，R：37次/min，BP：108/70mmHg。神清，双肺可闻及湿性啰音。入院诊断：①发热查因：重症肺炎（细菌?肺孢子菌肺炎?病毒?）；②I型呼吸衰竭；③慢性淋巴细胞白血病化疗后。入院后第2天行支气管镜检查留取右下肺分泌物送细菌、真菌培养，留取BALF送检mNGS。给予美罗培南(1g q8h 静滴)联合卡泊芬净(50mg qd 静滴)。检查结果回报：血常规：白细胞：4.03×109/L，中性粒细胞：72.6%，淋巴细胞：0.79×109/L，血小板：59×109/L，PCT：0.3ng/ml，呼吸道九联检：阴性，HIV抗体：阴性，BNP：646pg/ml，肌酐：72μmol/L，T细胞免疫：CD4：112个/μl。mNGS回报耶氏肺孢子菌感染，序列数为80，故停用美罗培南，改哌拉西林他唑巴坦、复方磺胺甲噁唑片(3片q6h 口服)联合卡泊芬净(50mg qd 静滴)抗感染。9d后患者症状好转，出院继续巩固治疗。复查肺部CT病灶较前吸收。

2 讨论

mNGS是对样本中的总DNA或RNA进行测序后再通过生物信息分析软件全面鉴定细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体[2]，它提供的是一种无偏的分析方法，理论上可识别所有已知序列的病原体，实现了从人体活检样本和体液(包括血液、尿液、脑脊液、胸腹水、局灶穿刺物、组织等)中检出病原体的目标。mNGS在死菌，使用抗生素的细菌，罕见、不典型及未知病原体，复杂混合感染的检出中优势明显。2014年Wilson等[6]报道了一名14岁男孩因不明原因脑积水、发热入院，最终利用mNGS方法检测出了脑脊液中存在钩端螺旋体，从而挽救了患儿生命的病例。

非 HIV 型 PCP 不同于 HIV 型 PCP。前者急性起病且进展快、病情重，普通检查常难以确诊，这就给非HIV感染的重症肺孢子菌肺炎患者带来了诊断上的困难，从而导致治疗延误，预后极差，病死率高[7，8]。mNGS克服了核酸诊断方法的局限性，因为它不需要预先了解或假设引起感染的病原体类型，就能检测新的和突发的病原体。本研究报道的4例患者均为非HIV患者，在常规经验抗感染效果欠佳的情况下，通过对患者BALF进行mNGS检测均发现高序列肺孢子菌，确诊为PCP。其中第1例患者在确诊后积极给予抗PJ治疗，但由于突发心脏骤停，家属放弃治疗并出院，其余3例患者在确诊后及时精准治疗均病情好转出院。研究显示[9]，通过mNGS早期明确诊断后，临床依据结果调整患者治疗方案，患者28d、90d生存率均有所提高，90d生存率从57.7%提高至83.3%。由于我国医疗水平存在地区差异，抗生素使用情况不容乐观，mNGS受抗生素影响小，在使用抗生素的前提下，mNGs的阳性率(91.3%)显著高于传统方法(43.5%)[3，10]，当然mNGS也有局限性，mNGS检测技术水平高，存在去人源化难度大、对RNA病毒检出率低、真菌和结核菌提取DNA相对困难等问题，尚缺乏统一、完善的检测流程和质量控制标准[11]。所以临床医生需要密切结合患者的临床表现和检查资料，避免非致病菌干扰并作出正确判读[12]。

综上，mNGS技术在感染性疾病诊断中发挥重要作用，其敏感性高，确诊时间快，可及时发现传统方法不易检出的致病菌，达到缩短病程，减少不必要的抗生素的使用，降低医疗成本的目的。对于具有“疑难、危重、特殊”特点的感染患者可以早期实现从“精准诊断”到“精准治疗”的过程，提高救治成功率。