主动脉中膜退行性变生物学检测研究进展

石烽，王志维

主动脉夹层（AD）及主动脉动脉瘤（AA）均属于心血管危重症，病理特点为主动脉中膜退行性变（AMD）。AMD主要病理生理机制为主动脉壁中膜弹力纤维断裂，血管平滑肌细胞（VSMC）表型转化，细胞外基质（ECM）降解，VSMC增殖迁移增加、凋亡增多导致主动脉结构和功能薄弱[1]。本文对AMD研究的常用生物学检测指标及检验技术作一综述。

1 表型转化

1.1 表型转化VSMC是主动脉中膜的重要组成成分，有收缩型和合成型2种表型[1]。正常情况下收缩表型的VSMC受到损伤、缺氧等刺激时，细胞的形态、结构、功能发生改变，即表型转化，转化后的合成表型VSMC体积增大、合成能力增强，此变化在发病早期可修复损伤血管，晚期失代偿后会导致主动脉壁弹性降低，脆性增加，引起AMD变化[2]。

1.2 骨桥蛋白骨桥蛋白（OPN）因介导骨组织与骨基质的连接得名，也表达在主动脉壁的合成表型VSMC中，现多用OPN表达变化验证主动脉壁是否发生了AMD。有研究报道，AA患者主动脉壁中膜的OPN表达水平较健康者明显增加，且OPN表达量与主动脉直径呈显著正相关[3]。有研究证实OPN的表达量与主动脉壁的结构和顺应性密切相关，当OPN高表达时，可引起主动脉壁中膜的胶原蛋白的含量增加，引起胶原蛋白与弹力蛋白动态平衡失调，引起主动脉壁弹力变弱，脆性增强，在心室高速血流冲击下，主动脉壁更易扩张乃至撕裂，导致AA及AD的发生[4]。当前在AMD病理生理变化的疾病研究中，OPN多被用于主动脉VSMC表型由收缩型向合成型转化的标记物。

1.3 α平滑肌肌动蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）是VSMC骨架的重要组成成分，在维持VSMC的收缩功能方面具有重要作用。现在多认为VSMC的表型转化过程是AMD重要的发病机制之一，而α-SMA是表型转化过程关键的调节因子。研究发现，胸主动脉AD患者中膜α-SMA表达量较健康者减少，进一步研究发现在AD原发破口周围，α-SMA减少水平更为显著, 部分区域α-SMA零表达[5]。Cheng等[6]通过敲除小鼠α-SMA表达相关基因（ACTA2），发现其主动脉出现瘤样扩张甚至AD改变。这表明在AMD表型转化过程中, 随VSMC由收缩表型向合成表型的转化，收缩表型的VSMC明显减少，α-SMA表达量降低，导致主动脉中膜血管壁收缩能力下降，弹性变差，中膜更易被血流撕开形成夹层病变。综上，我们发现α-SMA已被认为是VSMC表型转化早期特异性的标志物，既是收缩型VSMC的标志蛋白，也是AA及AD研究中证实其发生了AMD表型转化的标记蛋白。

2 ECM降解

2.1 ECM主动脉壁中膜主要由VSMC和ECM构成，ECM在主动脉壁正常组织结构和功能、细胞生长和分化方面发挥着重要作用。ECM重构是AMD发生的重要病理基础，关于AMD在ECM重构方面的研究主要集中在蛋白相关的水解酶上[7]。

2.2 MMPsMMPs属蛋白水解酶家族，由主动脉VSMC及炎性浸润细胞分泌，可特异性降解存在于主动脉中膜的弹性纤维、胶原胶原、纤维连接蛋白，引起主动脉壁中膜的薄弱，继而引发AMD过程[8]。研究显示，在AD主动脉壁中MMP-2通过核转录因子κB、丝裂原活化蛋白激酶等通路被上调表达，而核因子激酶抑制剂能通过抑制炎症相关下游通路，保护实验动物很大程度免于急性AD风险的作用[9]。通过对AD患者主动脉壁免疫染色发现，相较于夹层远端破口及正常主动脉组织，MMP-1在夹层破口起始处的中膜部位表达明显上调，此结果可能表明夹层中的MMPs的活性改变与AMD的发生相关[10]。国内一项研究发现在AA发病早期，MMP-2和MMP-9在主动脉根部瘤患者的主动脉壁中膜大量表达，通过抗血小板药物抑制血小板活化后，主动脉壁的MMP-2和MMP-9表达量显著降低，弹力蛋白和胶原蛋白的降解明显减少，AA的病理损伤严重程度减轻[11]。在AA及AD的研究中，现多以MMP-2及MMP-9表达增加作为AMD过程中ECM损伤的标记物。

3 细胞增殖迁移

3.1 VSMC增殖迁移受到血管外部环境变化刺激，VSMC发生异常增殖和迁移引起新生血管管壁的增厚，引起再狭窄、硬化，促进AMD形成，故VSMC的增殖与迁移被认为是AMD发病机制中的关键因素[12]。

3.2 CCK-8和流式细胞术实验CCK-8实验和流式细胞术是检测细胞增殖数量的重要手段。CCK-8试剂盒中含有的WST-8能被细胞内脱氢酶还原成橙色的甲臜，其生成量与活细胞数量成正比，由此能高度准确地检测细胞增殖数目。流式细胞术是一种通过测定细胞表面荧光标记的抗体-目的蛋白产生的荧光强度，分析细胞数目、增殖周期、细胞表面和胞内分子的表达、鉴定并确定异质细胞群中的不同细胞类型、评估分离亚群的纯度等多个参数的高新技术。Wang等[13]通过CCK-8实验发现，AD组织中的VSMC增殖速度快于正常主动脉，且与细胞增殖相关的蛋白表达水平也升高。踝蛋白1位于VSMC和ECM之间的粘附复合物上，具有促进细胞粘附作用，主要表达于血管平滑肌、肝、肾等[14]。Wei等[15]通过流式细胞术发现与正常主动脉组织相比较，踝蛋白1在人AD主动脉壁组织中的表达降低，在敲低人主动脉VSMC的踝蛋白1基因表达后,VSMC的增殖能力明显增加。任明明等[16]通过流式细胞术发现组织金属蛋白酶抑制因子3可使AA患者主动脉中膜G1期的VSMC比例明显减少，S期细胞比例明显增加，即VSMC增殖较对照组减慢，证实其可以延缓腹主动脉瘤进展。现多用CCK-8实验和流式细胞术检测发生了AMD变化的VSMC其增殖数量及速率是否发生改变。

3.3 Transwell实验及划痕实验Transwell是一种应用Transwell小室来探究细胞共培养、细胞迁移、细胞趋化等问题的实验技术。将Transwell小室放入培养皿中，小室内称上室，培养皿内称下室，上下室内的培养液以膜相隔，并在膜上室之间铺以基质胶来模拟ECM成分。如果上室的细胞迁移到下室需先分泌MMPs将基质胶降解才能通过膜，计算进入下室的细胞数量即可反映细胞的迁移能力。划痕实验即用移液枪枪头垂直在铺满细胞的培养基上划线来制造划痕，划痕上的细胞被机械外力去除之后，通过一段时间的培养，可观察到无细胞区再次出现细胞生长，通过计算划痕区的细胞数量可反映细胞的迁移能力。Transwell实验多反映细胞立体迁移能力，划痕实验多反映细胞平面迁移能力。研究发现miR-19a在AA患者组织和血清中高表达，过表达miR-19a后通过Transwell实验发现VSMC迁移增多，加重了AA病变程度，而敲低miR-19a可抑制VSMC迁移及缓解炎症因子和MMPs的表达，缓解AA的发展[17]。安朝等[18]通过划痕实验与Transwell迁移实验显示过表达NANOG增强了VSMCs在水平方向和垂直方向的迁移能力，进一步进行划痕实验与Transwell迁移实验研究发现敲低OPN逆转了过表达NANOG 引起的VSMCs迁移能力增强。现多用Transwell实验和划痕实验检测发生了AMD变化的VSMC其迁移能力是否发生改变。

4 细胞凋亡

4.1 VSMC凋亡VSMC是主动脉中膜的主要细胞成分，其与中膜ECM交互共同维持主动脉壁结构和功能的完整性，中膜的弹力蛋白也主要由VSMC合成，因此，VSMC的数量和功能异常势必削弱主动脉壁对抗炎症及蛋白酶裂解的能力。在人类AA组织标本中发现中膜VSMCs减少，VSMC空泡化增加，细胞核固缩、核碎裂、溶解明显增多，这些结果提示发生了AMD病变的VSMC多发生了细胞凋亡[19]。

4.2 Tunel检测与流式细胞术细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这部分DNA内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA断裂时暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上红色荧光探针Cyanine 3标记的dUTP，从而通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这是TUNEL法检测细胞凋亡的原理。有研究通过TUNEL染色发现AD组小鼠主动脉凋亡增加，P53表达显著上调，当小鼠体内给予P53抑制剂或P53敲除的转基因小鼠其TUNEL染色检测到的VSMC凋亡明显减少[20]。研究报道miR-19a在腹AA患者组织和血清中均明显高表达，通过流式细胞术检测到的VSMC凋亡较对照组明显增多，在敲低miR-19a后流式细胞术检测到的VSMC凋亡数量得到缓解[17]。也有研究报道AD造模小鼠的G蛋白偶联受体35表达显著增加，且AD组Tunel染色检测到的VSMC细胞凋亡率较对照组明显增加，而G蛋白偶联受体35基因敲除的小鼠体内Tunel染色发现VSMC细胞凋亡率较AD组明显降低[21]。在AMD的基础研究中现多用TUNEL染色或流式细胞术检测主动脉中膜的VSMC是否发生了凋亡。

5 总结与展望

AA与AD从病理学角度分析均发生了AMD过程，以往关于AMD的病理生理过程研究包括ECM降解、VSMC的表型转化、增殖和迁移等。随着AMD的基础研究逐渐增多，AMD的研究取得了巨大进步，但目前尚无关于AMD研究相关常用生物学指标及检测技术的报道。本文从VSMC的表型转化、ECM降解、VSMC增殖迁移及VSMC凋亡这4个方面详述了AMD的发生过程及相关基础研究常用生物学指标及检验技术，旨在为后续AMD的基础研究提供方向，推动对AMD研究的共识探讨。但AMD是否存在其他作用潜在病理生理过程，以及后期关于AMD研究是否存在更先进检测技术或生物学指标，仍有较多疑问，需对AMD进行更深入的研究。