流产衣原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

温 渊，刘东慧，李兆才，谭书敏，梁 林，黄 勇，周继章*

(1. 中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046；2. 西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

衣原体(Chlamydia)是一类专性胞内寄生的革兰氏阴性菌，具有复杂的形态结构，依赖宿主的能量合成自身的代谢物质，是一种重要的人畜共患病原体[1]。衣原体科下只有一个衣原体属，共有14个衣原体种[2]，其中的流产衣原体(Chlamydiaabortus,C.abortus)是导致绵羊衣原体病的主要原因。绵羊衣原体病是一种重要的人畜共患病，又称绵羊地方性流产(Enzootic abortion of ewes, EAE)[3]。母羊感染流产衣原体后会导致化脓性胎盘炎、早产、产出死胎或虚弱的羊羔，并且母羊成为病原体携带者，在孕期通过胎盘、流产胎儿或阴道分泌物排出大量病原体，感染其他动物或人类[4-5]。此外，孕妇可能在接触感染动物后患病，导致流产[6]。流产衣原体的主要宿主是家畜，但在全球各地的其他物种中也发现了零星病例，如马和鹿等[7-8]，甚至野鸭中也有发现，感染宿主极其广泛，其引起的大规模流产给全球大多数地区造成了不容忽视的经济损失[7]。

目前我国对流产衣原体大规模诊断的方法主要有IHA技术和常规PCR技术，但IHA技术操作繁琐且灵敏度较低，常规PCR只能进行定性检测。实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好及操作简便等特点，在分子生物学诊断方面有广泛应用。国内针对流产衣原体实时荧光定量PCR方法的研究相对较少，张志君和周丹娜等分别建立了针对流产衣原体的SYBR Green Ⅰ方法和分子信标探针方法[9-10]，但这些方法尚未在临床检测和动物衣原体病的流行病学研究中大规模应用。TaqMan探针法比SYBR Green Ⅰ方法具有更强特异性和灵敏度，与分子信标探针法比较具有操作简便、成功率高等优点。因此，本研究以衣原体蛋白酶样活性因子(Chlamydial protein-like activity factor, CPAF)的基因组序列为靶基因设计针对流产衣原体的引物及TaqMan探针，旨在建立一种快速、特异的TaqMan实时荧光定量PCR方法，为流产衣原体的早期诊断提供可靠方法。

1 材料与方法

1.1 菌株及基因组 流产衣原体GN6菌株、沙眼衣原体基因组、大肠杆菌基因组、沙门氏菌基因组均在中国农业科学院兰州兽医研究所畜禽重要人兽共患病团队细菌病组保存。布鲁氏菌基因组由中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物细菌病团队提供。刚地弓形虫基因组由中国农业科学院兰州兽医研究所畜禽重要人兽共患病团队寄生虫组提供。

1.2 主要试剂 2×Premix Ex TaqTM、pMD19-T载体、感受态细胞DH5α购自大连宝生物工程有限公司。质粒小提试剂盒、小提胶回收试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司。DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。QuantiNova Probe PCR Kit购自深圳凯杰生物工程有限公司。

1.3 引物探针的设计 比对了GenBank中不同衣原体种CPAF的编码基因序列，包括ChlamydiaabortusLLG(GenBank NZ_CP018296.1)、Chlamydiamuridarumstr.Nigg(GenBank NC_002620.2)、Chlamydiapsittaci6BC(GenBank NC_017287.1)、ChlamydiapneumoniaeTW-183(GenBank NC_005043.1)、ChlamydiapecorumPV3056/3(GenBank NC_022439.1)、Chlamydiasuis(GenBank NZ_LS398098.1)，设计多对针对流产衣原体CPAF的基因引物及TaqMan探针。

1.4 引物探针的筛选 以布鲁氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫及沙眼衣原体的基因组作为模板，以流产衣原体基因组为阳性对照，ddH2O为空白对照进行实时荧光定量PCR试验，对初步设计的多对引物探针进行特异性筛选。

1.5 DNA的提取 本试验菌株DNA的提取参考北京天根生化科技有限公司的DNA提取试剂盒步骤操作。

1.6 标准质粒的构建 以筛选出的引物作为扩增引物，以流产衣原体GN6菌株的DNA作为模板进行PCR扩增，产物胶回收后克隆到pMD19-T载体中。将重组质粒转化DH5α感受态细胞，涂布于LB Amp平板上，37 ℃过夜培养，挑取单克隆，LB培养基增菌培养后进行菌液PCR鉴定并送至西安擎科生物科技有限公司测序，提取阳性菌液的质粒。利用分光光度计测定阳性重组质粒pMD19T-CPAF的浓度并换算拷贝数。

1.7 实时荧光定量PCR方法的优化 采用矩阵法对引物浓度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 μmol/L)、探针浓度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 μmol/L)和退火温度(55 ℃～65 ℃)分别进行实时荧光定量PCR反应，最终筛选出最佳引物探针浓度及退火温度。

1.8 标准曲线的建立 以10倍倍比稀释后的重组质粒pMD19T-CPAF为模板进行实时荧光定量PCR反应，构建该方法的标准曲线。

1.9 特异性试验 以布鲁氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、沙眼衣原体基因组为模板，流产衣原体的基因组为阳性对照，设立空白对照进行试验。

1.10 灵敏度试验 以稀释后的重组质粒为模板，设立空白对照，分别进行普通PCR和实时荧光定量PCR试验，得到两种方法可以检出重组质粒的最低拷贝数。

1.11 重复性试验 以浓度为2.6×107～2.6×104copies/μL的重组质粒作为模板，作3个平行对照，进行组内重复试验，再重复3次组内重复试验，进行组间重复试验，计算不同梯度的Ct平均值、标准差及变异系数(%)，评估组内及组间差异。

1.12 临床样本检测 从甘肃省某流产绵羊饲养场采集生殖道拭子共156份。为了鉴定导致该羊场流产的病原体，分别对采集的样本进行流产衣原体、布鲁氏菌、贝纳柯克斯体(Coxiellaburneti)、Waddliachondrophila、李斯特氏菌(Listeriamono￣cytogenes)及弓形虫进行实时荧光定量PCR检测。合成Waddliachondrophila、李斯特氏菌[11]及贝纳柯克斯体[12]的特异性引物及探针，弓形虫、布鲁氏菌引物及探针由本实验室保存。使用本研究建立的方法和OIE参考推荐的方法分别检测该批临床样本，通过统计流产衣原体的检出率，比较两种方法的灵敏度。

2 结果与分析

2.1 引物探针的设计 设计了8对针对流产衣原体CPAF基因的特异性引物及探针(表1)。

2.2 引物探针的筛选 筛选结果显示，只有Cab-CPAF8引物探针与其它病原物无交叉反应，证明其特异性良好(表2)。

2.3 重组质粒pMD19T-CPAF的鉴定 重组质粒pMD19T-CPAF经过PCR扩增后使用琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像仪下观察结果并拍照。pMD19T-CPAF片段大小约为113 bp(图1)，与预期结果相同，菌液送西安擎科生物科技有限公司测序，结果显示目的基因成功插入重组质粒。大量提取阳性质粒，在紫外分光光度计下测定其浓度为79 ng/μL，拷贝数为2.6×1010copies/μL。

表1 Cab-CPAF1～Cab-CPAF8引物探针序列Tab 1 Sequences of Cab-CPAF1～Cab-CPAF8 primers and probes

表2 Cab-CPAF8引物和探针的序列Tab 2 Sequence of Cab-CPAF8 primers and probe

M：DL2000 Marker；1：pMD19T-CPAF扩增产物；2：阴性对照M: DL2000 Marker; 1: Amplification of pMD19T-CPAF; 2: Negative control图1 重组质粒pMD19T-CPAF PCR扩增结果Fig 1 The result of pMD19T-CPAF by PCR

2.4 实时荧光定量PCR方法的建立及优化 经过优化，最终确定反应体系：2×Premix Ex Taq 10 μL，Cab-F 0.5 μL，Cab-R 0.5 μL，Cab-P 0.5 μL，DNA 2 μL，ddH2O补齐至20 μL。反应条件：95 ℃预变性；95 ℃变性 10 s，57 ℃退火 10 s，44个循环。

2.5 标准曲线的构建 当重组质粒浓度在2.6×107～2.6×102copies/μL时，其标准品拷贝数的对数值(x)与Cq值(y)存在良好的线性关系，线性方程y=-3.209x+40.773，R2=0.995，扩增效率E=105%(图2)。

2.6 特异性试验 结果显示，除流产衣原体的基因组DNA有特异性扩增外，其他菌株基因组DNA均未检测到(图3)，表明该方法特异性良好。

2.7 灵敏度试验 普通PCR可检出重组质粒最低浓度为2.6×102copies/μL(图4)，实时荧光定量PCR可检出最低浓度为2.6×101copies/μL(图5)，灵敏度是普通PCR的10倍。

2.8 重复性试验 组内变异系数为0.199%、0.445%、0.634%和0.969%，组间变异系数为1.45%、1.8%、2.33%和2.62%，均小于3%，证明本方法具有良好的重复性(表3和图6)。

2.9 临床样本检测 表4结果显示，该羊场大部分绵羊流产是由于流产衣原体和贝纳柯克斯体混合感染导致；通过本次156份临床样本检测比较了本研究建立方法和OIE参考推荐方法的灵敏度，两种方法检出的流产衣原体总阳性率分别为78.21%和73.72%，表明本研究建立的方法灵敏度更高。

图2 流产衣原体实时荧光定量PCR标准曲线Fig 2 Standard curve of real-time fluorescence quantitative PCR for C.abortus

1：阳性对照；2～6：布鲁氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、沙眼衣原体、弓形虫；7：阴性对照1: Positive control; 2～6: Brucella, Escherichia coli, salmonella, Chlamydia trachomatis,Toxoplasma gondii; 7: Negative control图3 特异性试验结果Fig 3 The result of the specificity assay

M：DL2000 Marker；1～8：浓度为2.6×108～2.6×101 copies/μL的阳性重组质粒；9：阴性对照M: DL2000 Marker; 1～8: The positive recombinant plasmid at 2.6×108～2.6×101 copies/μL;9: Negative control图4 普通PCR灵敏度试验结果Fig 4 Sensitivity result of PCR

1～7：2.6×107～2.6×101copies/μL阳性重组质粒1～7: The positive recombinant plasmid at 2.6×107～2.6×101 copies/μL图5 实时荧光定量PCR灵敏度试验结果Fig 5 Sensitivity result of real-time fluorescence quantitative PCR

1:第一次试验；2：第二次实验；3：第三次实验1: First test; 2: Second test; 3: Third test图6 重复性试验结果Fig 6 The result of the repeated test

表3 实时荧光定量PCR组内和组间重复性试验结果Tab 3 Intra-group and inter-group reproducibility test results of real-time fluorescence quantitative PCR

表4 临床样本检测结果Tab 4 Results of clinical sample test

3 讨论与结论

随着流产衣原体的流行范围不断扩大，其对畜牧业发展的危害愈发严重，已经引起了兽医界的广泛关注。近些年的研究显示，流产衣原体可感染的宿主越来越广泛，不仅可以感染牛、羊等陆地上的反刍动物，而且还会感染海洋中的哺乳动物，一项研究报告指出，地中海搁浅的斑纹海豚中通过PCR仅检测到流产衣原体，可能是斑纹海豚搁浅和死亡的原因，这是首次在海洋哺乳动物中发现流产衣原体的病例[13]。受感染的动物可能会成为感染源而感染人类，导致患者全身感染或流产[14]。

目前，流产衣原体病的防控主要采用疫苗接种防治，但最近研究表明流产衣原体1B型疫苗未能对流产衣原体感染动物产生免疫保护作用，反而可能会导致动物流产[15]。流产衣原体病的防控不仅需要疫苗的开发应用，也需要早期的及时诊断，其严重程度也离不开流行病学的调查。我国针对流产衣原体病的检测技术主要依靠IHA，但该方法检测结果需要通过肉眼判定，存在人为主观性，并且敏感性较低，同时，针对流产衣原体主要外膜蛋白的套式PCR技术虽然简便、快速，但是特异性及灵敏度不高，易产生假阳性的结果。TaqMan实时荧光定量PCR是一种操作简便、特异性强、灵敏度高的诊断技术，可以快速且准确定量样本中的病原体数量，无需电泳步骤，大大提高了检测效率。

本研究通过对某羊场流产原因的检测分析，比较了本研究建立的方法与OIE参考推荐方法的灵敏度，结果显示，本研究建立的方法灵敏度要高于OIE参考推荐的方法，表明了该方法不仅适用于临床样品的大规模检测且具有较高的灵敏度。

综上，本研究基于CPAF基因序列，设计了一组针对流产衣原体的特异性引物探针，通过优化该方法的反应体系和反应条件，建立了一种操作简便且具有良好的灵敏度、特异性和重复性的流产衣原体TaqMan探针实时荧光定量PCR诊断方法。该方法具有自主知识产权，为流产衣原体病的流行病学调查提供了技术手段，为流产衣原体病的防控奠定了基础。