衣原体最新分类体系与分类鉴定方法研究进展

李 鹏(综述)，端 青，宋立华(审校)

衣原体是一类专性真核细胞内寄生、具有独特发育周期、可以在多种真核生物宿主(包括人、动物、原虫等)中繁殖的细菌。这类菌的共同特征是：(1)革兰染色阴性；(2)有核糖体和细胞壁；(3)有独特的发育周期，有感染能力的始体(EB)首先在胞浆囊泡内分化成有繁殖能力的网状体(RB)，RB以二分裂方式繁殖，在发育周期的中后期RB重新分化为EB；(4)含有DNA和RNA两类核酸。衣原体感染宿主广泛，可以引起人与动物多种疾病，感染人可导致沙眼、肺炎、泌尿系统疾病等，感染动物如家禽、家畜可导致严重经济损失[1]。本文综述了衣原体分类的新进展与衣原体的生物学与分子生物学分类特征，对衣原体分类鉴定、流行病学调查等具有指导意义。

1 衣原体最新分类体系

衣原体按照细菌分类学，界、门、纲、目、科、属、种进行具体划分。最新的第2版《伯杰系统细菌学手册》(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)依据16S rRNA基因的同源性将衣原体归为独立的衣原体门(Chlamydiae)[2]。衣原体门包括一个衣原体纲(Chlamydiia)，一个衣原体目(Chlamydiales)，衣原体目下设8个科、11个属。其中与人或动物衣原体病相关的衣原体主要归类到衣原体科(Chlamydiaceae)，该科有一个衣原体属(Chlamydia)，包含12个衣原体种：沙眼衣原体(C.trachomatis)、鼠衣原体(C.muridarum)、猪衣原体(C.suis)、肺炎衣原体(C.pueumoniae)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、流产衣原体(C.abortus)、家畜衣原体(C.pecorum)、豚鼠衣原体(C.caviae)、猫衣原体(C.felis)、朱鹭衣原体(C.ibidis)[3]、鸟衣原体(C.avium)和家禽衣原体(C.gallinacea)[4]。其中朱鹭衣原体、鸟衣原体和家禽衣原体是新发现的衣原体种(详介见下面)。图1显示了衣原体科内各代表种与其它科代表菌株的16S rRNA进化地位。

上一次衣原体分类体系的变革发生在1999年，美国学者Everett等以16/23S rRNA序列相似度为依据，提出了建立嗜衣原体属(Chlamydophila)和多个新种如猪衣原体、流产嗜衣原体、豚鼠嗜衣原体和猫嗜衣原体等[5]。在这个旧的分类体系中，新划出的几个衣原体新种得到了认可，但关于嗜衣原体属的提议遭到了多数衣原体学家的反对。该属当时只有一个种水平上的鉴定依据—rRNA序列同源性大于95%，这个分类依据遭到了质疑，原因概括有：①16S rRNA虽被称为细菌进化的化石，但分类学家已发现16S rRNA序列分析不适用于所有细菌种的鉴定；②没有传统上易接受的生物学分类标记，成立嗜衣原体属的必要性不充分；③仅有的rRNA分类依据在属分类上已造成了混乱，如鼠衣原体与豚鼠嗜衣原体属于两个属但它们的16S rRNA同源性性却大于95%[6]。国际衣原体分类委员会于2009年取消了嗜衣原体属的说法[7-8]。第2版《伯杰细菌学系统手册》也依据命名稳定、避免混淆的原则只保留了“衣原体属”的命名。事实上嗜衣原体属的提议一直没有得到统一应用，最新的衣原体分类体系在实际应用中具有更鲜明的指导意义[9]。

2 新发3种衣原体—朱鹭衣原体、鸟衣原体和家禽衣原体

Vorimore等在2013年报道了在法国西部的野生鸟—埃及圣鹮(feral sacred ibis)上分离到一个新衣原体种—朱鹭衣原体(Chlamydiaibidis)[3]；埃及圣鹮的学名为Threskiornisaethiopicus，属于鹮属，朱鹭科；Ibidis是ibis(朱鹭)的所有格，我们因此将Chlamydiaibidis翻译为朱鹭衣原体，有两个分离株10-1398/6和10-1389/1，其中10-1398/6为模式株。

Fig.1 Total length sequence of 16S rRNA phylogenetic tree of representative strains in Chlamydiales

Konrad等通过分析鸽子、鹦鹉、家禽中的未归类衣原体分离株，提出命名两个新种—鸟衣原体(Chlamydiaavium)和家禽衣原体(Chlamydiagallinacea)[4]，二者的模式菌株分别是10DC88，08-1274/3。目前已知的鸟衣原体菌株来源于鸽子和鹦鹉，而家禽衣原体菌株则分离自肉鸡、珍珠鸡、火鸡及其它家禽。

以上3种新发衣原体均可以从鸟类的泄殖腔和粪便中分离到，在电镜下有典型的RB与EB，可以用接种鸡胚卵黄囊法或细胞法培养，但它们的致病性还不明确。多数动物衣原体的宿主存在多样性，它们很有可能会感染其它的鸟类或动物，甚至人。衣原体的种类和宿主范围都在扩展，生物多样性在衣原体学科上初步开始展现，可能还有较多的未知衣原体有待发现，有待于衣原体专业工作者去研究。

3 衣原体分类鉴定方法

衣原体的分类鉴定依据经历了从传统方法(形态结构、生化特征、抗原结构、血清学方法等)到近年来越来越倚重分子遗传学方法的发展过程。1956年我国学者汤飞凡等首次报道了在沙眼患者病料中分离到沙眼病毒，这是衣原体研究史上的一个里程碑进展[10]。在分离到沙眼病原后，1957年衣原体根据宿主的不同被分为两个种：感染动物的鹦鹉热衣原体、与感染人眼部或生殖道系统的沙眼衣原体，详见《第八版伯杰细菌鉴定手册》(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Eight Edition)。近60年过去了，如前所述，衣原体的分类系统已发生了巨大变化。每一个新科、新种的定义都是分析衣原体分类学研究的例子。目前的衣原体的分类鉴定依据是传统分类方法与分子遗传学方法的融合，一个很好的例子就是新发现的朱鹭衣原体的分类与鉴定。

3.1传统的形态结构分析与血清学方法仍是衣原体分类鉴定重要依据 传统的衣原体分类鉴定依据主要有形态结构、糖原的积累、磺胺嘧啶敏感性、血清学方法等。基于衣原体的描述性定义可以看出，在生物表型上目前已知的衣原体均有独特的发育周期，也即具有EB与RB两种结构形式，因此通过电镜进行形态学分析是衣原体鉴定的第1步，特别是新发现衣原体的分类鉴定。电镜不是微生物分类的常用工具，但可直接提供衣原体的形态、原核本质、细胞壁结构等，是研究或分类衣原体的重要工具。早前，生物学特征如糖原染色特性与磺胺嘧啶敏感性，曾用于沙眼与鹦鹉热衣原体种的鉴别[2]。表1概括了衣原体属内10个种的基本生物学特征，可以看出随着衣原体种类的增加，传统的有限的生物学特征已不能适应衣原体分类的需要。事实上现在已知，由于衣原体不能进行胞外繁殖、不同的衣原体专业实验室有自己传统的研究平台，个别表型如糖原染色性质等在不同的实验体系上可能存在较大差异。在体外研究模型中，有限的、还可能是不稳定的衣原体理化性质分类依据已成为历史。

血清学方法常用于衣原体的详细分类，特别是常见衣原体种如沙眼衣原体与鹦鹉热衣原体的血清学分型。目前沙眼衣原体有15个血清型，分别为A，B，Ba，C-K，L1，L2，L3，其中A-C为眼睛生物型，D-K为生殖生物型，L1-L3为LGV生物型[2]；鹦鹉热衣原体有9个血清型，分别为A-F，E/B，M56与WC。衣原体的血清型特异性抗原决定簇均位于ompA编码的主要外膜蛋白(MOMP)，在实际应用中血清分型已被ompA基因分型代替[11]。MOMP是衣原体外膜的主要组成部分，是衣原体的黏附素之一，是重要的衣原体中和保护性抗原。以上众多的血清型表明MOMP有可能在衣原体的免疫逃避中发挥作用，这对研制具有泛保护活性的衣原体疫苗具有指导意义[12-13]。虽然ompA基因分型已普遍应用，但在鉴定新的ompA基因型时仍需要使用血清学方法(中和实验或免疫荧光)进行验证。值得一提的是，ompA被认为是衣原体发生变异或重组的活跃基因，但目前临床上还没有发现新的ompA基因型，未来大范围的ompA流行病学调查将有助于理解ompA的变异性或保守性及其在衣原体进化中的作用。

Tab.1 Basic biological characteristics of 12 species in Chlamydia

3.2分子遗传学方法是目前衣原体分类鉴定的常用方法和标准方法 目前衣原体分类鉴定的分子遗传学依据主要有16S rRNA序列分析、ompA序列分析(也用于基因分型)、特异性基因分析和级联基因序列分析等。①由于16S rRNA基因的高度保守性和种属差异性，其是目前细菌学分类鉴定的金标准，Everett等提出的在科属水平上分类衣原体的16S rRNA同源性阈值已被认可。第二版《伯杰系统细菌学手册》依据16S rRNA基因全长序列的同源性成立了衣原体门，衣原体门内16S rRNA相似性>80%，衣原体目内不同科间的16S rRNA相似性为80%～90%，同一科不同属间的16S rRNA相似性>90%，各属内部的16S rRNA序列相似性>95%，株与株之间16S rRNA序列相似性>99%时认为它们是同一种中的不同株[2]。②除了16S rRNA，ompA序列分析常用于衣原体种的鉴定与基因分型。③特异性基因分析是衣原体分类鉴定的一个方法，可参考Griffiths等在Everett的分类系统基础上对衣原体蛋白质组进行的BLAST分析结果。作者共筛选出了59个衣原体门特异蛋白、79个衣原体科特异蛋白、衣原体属和嗜衣原体属特异蛋白各20个[14]。④级联基因序列分析是理解衣原体亲缘性和进化关系的一个补充方法。Richard等将110个衣原体保守基因串联后进行种系发育分析[6]，结论与16S rRNA系统发生树有所不同，体现了这个方法的价值。在对发现朱鹭衣原体的文章中，Vorimore等对16S rRNA、ompA、及31个保守基因级联后进行了序列比较分析，确认了其为衣原体科的一个新物种。

3.3全基因组分析是分类鉴定新发现衣原体的必要方法 随着测序技术的发展，微生物基因组学已进入了大数据时代，基因组序列现已成为报告新发现微生物的必需数据，如发现朱鹭衣原体的文章同时发表了代表株的全基因组序列。将全基因组引入细菌的分类鉴定具有积极的意义。与传统分类依据相比，基因组为微生物分类鉴定提供了更加丰富的分类依据，更能相对准确地体现微生物的自然进化史。分类学家利用了全基因组序列中更多的分类特性来确定种属相似度，如基因的排列顺序、核心基因的分析(基因的存在、缺失或序列比对)、核心基因中单核苷酸的多态性、种系发育树构建、同源基因的平均核酸序列一致性(AverageNucleotideIdentity, 简写为ANI)等。在全基因组测序使用中，一般认为ANI值>96%则两株细菌属于同一个种，这一数据的应用在16S rRNA序列相似性>98.7%时显得尤为重要[15]。

目前使用基因组进行系统分类还有局限性[16]，①微生物主要谱系的全基因测序数据还很缺乏；②即使有全基因组数据可以利用，但其并不是典型菌株，其可靠性还有待商榷；③由于测序手段和技术的差异使得已经完成的全基因组数据存在很大差别，需要对最小测序质量提出一个定义，来解决全基因组测序的差异性；④衣原体为专性胞内寄生，培养和纯化的技术要求高，加上全基因组分析需要专业的生物信息学支持，故目前只有少数专业实验室具备衣原体全基因组分析能力；⑤基因组学虽然极大促进了进化与分类学研究，但应当看到我们对微生物进化的理解还很有限，还需要从基因功能的方向继续深入研究。尽管有以上局限性，由于衣原体专性在囊泡内繁殖、其接触外源基因的几率低、其基因组被认为高度保守，全基因组分析在衣原体分类上的应用有特殊的优势。

4 结 语

衣原体是一大类与人关系密切的微生物，其分类体系对教学、科研等均有直接的指导意义。最新衣原体分类体系的最大变化是取消了嗜衣原体属，3种新发衣原体使衣原体属进一步扩展到了12个种。除了3种新发衣原体，这个分类方法已得到国外衣原体学家的认可，我国也有必要在今后使用这个分类系统。目前衣原体分类鉴定的常用方法主要有16S rRNA、ompA及其它特异性基因序列分析，级联基因序列分析；形态结构和血清学特征是定义、分型衣原体的重要依据；全基因组测序为分类鉴定新发现衣原体提供了强有力的工具。无疑，衣原体的分类体系与方法仍在快速发展中，特别是新发现衣原体种的快速增加，如2013年8月PLoS ONE杂志报道的重要鱼类衣原体病原体CandidatusSyngnamydia venezi[17]。随着更多新发现衣原体种的分类鉴定和分类方法的发展，衣原体分类系统将更臻合理完善。

参考文献：

[1]Wu YM.Chlamydiae[M]. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2012 : 1. (in Chinese)

吴移谋.衣原体[M].北京:人民卫生出版社,2012:1.

[2]Noel RTS, Daniel RB, Brian P. Bergey’s manual of systematic bacteriology[M]. New York: Springer, 2010:843-878.DOI: 10.1007/978-0-387-68572-4

[3]Vorimore F, Hsia RC, Huot-Creasy H, et al. Isolation of a new Chlamydia species from the Feral Sacred Ibis (Threskiornisaethiopicus):Chlamydiaibidis[J]. PLoS One, 2013, 8(9): 1-11. DOI: 10.1371/journal.pone.0074823

[4]Sachse K, Laroucau K, Riege K, et al. Evidence for the existence of two new members of the familyChlamydiaceaeand proposal ofChlamydiaaviumsp. nov. andChlamydiagallinaceasp. nov[J]. Syst Appl Microbiol, 2014. DOI: 10.1016/j.syapm.2013.12.004

[5]Everett KD, Bush RM, Andersen AA. Emended description of the orderChlamydiales, proposal ofParachlamydiaceaefam. nov. andSimkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the familyChlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms[J]. Int J Syst Bacteriol, 1999, 49: 415-440.

[6]Stephens RS, MyersG, Eppinger M, et al. Divergence without difference: phylogenetics and taxonomy ofChlamydiaresolved[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2009, 55(2): 115-119. DOI: 10.1111/j.1574-695X.2008.00516.x

[7]Greub G. International committee on systematics of prokaryotes. subcommittee on the taxonomy of theChlamydiae: minutes of the closed meeting, 21 June 2010, Hof bei Salzburg, Austria[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2010, 60: 2694. DOI: 10.1099/ijs.0.028233-0

[8]Greub G. International committee on systematics of prokaryotes. subcommittee on the taxonomy of theChlamydiae: minutes of the inaugural closed meeting, 21 March 2009, Little Rock, AR, USA[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2010, 60: 2691-2693. DOI: 10.1099/ijs.0.028225-0

[9]Bavoil P, Kaltenboeck B, Greub G. InChlamydiaveritas[J]. Pathog Dis, 2013, 67(2): 89-90. DOI: 10.1111/2049-632x.12026

[10]Tang FF, Zhang XL, Huang YT, et al. Trachoma pathogen research Ⅳ. Vaccination chicken embryos, virus isolation[J]. J Microbiol, 1956, (02): 189-210+402-404. (in Chinese)

汤飞凡,张晓楼,黄元桐,等.沙眼病原研究 Ⅳ.接种鸡胚,分离病毒[J].微生物学报,1956,(02):189-210+402-404.

[11]Brunelle BW, Sensabaugh GF. TheompAgene inChlamydiatrachomatisdiffers in phylogeny and rate of evolution from other regions of the genome[J]. Infect Immun, 2006, 74(1): 578-585. DOI: 10.1128/iai.74.1.578-585.2006

[12]Kollipara A, Polkinghorne A, Beagley KW, et al. Vaccination of koalas with a recombinantChlamydiapecorummajor outer membrane protein induces antibodies of different specificity compared to those following a natural live infection[J]. PLoS One, 2013, 8(9): 1-14. DOI: 10.1371/journal.pone.0074808

[13]Cheng C, Pal S, Tifrea D, et al. A vaccine formulated with a combination of TLR-2 and TLR-9 adjuvants and the recombinant major outer membrane protein elicits a robust immune response and significant protection against aChlamydiamuridarumchallenge[J]. Microbes Infect, 2013. DOI: 10.1016/j.micinf.2013.11.009

[14]Griffiths E, Ventresca MS, Gupta RS. BLAST screening of chlamydial genomes to identify signature proteins that are unique for theChlamydiales,Chlamydiaceae,ChlamydophilaandChlamydiagroupsof species[J]. BMC Genomics, 2006, 7(14): 1-20. DOI: 10.1186/1471-2164-7-14

[15]Zhi XY, Zhao W, Li WJ, et al. Prokaryotic systematics in the genomics era[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2012, 101(1): 21-34. DOI: 10.1007/s10482-011-9667-x

[16]Sentausa E, Fournier PE. Advantages and limitations of genomics in prokaryotic taxonomy[J]. Clin Microbiol Infect, 2013, 19(9): 790-795. DOI: 10.1111/1469-0691.12181

[17]Fehr A, Walther E, Schmidt-Posthaus H, et al.CandidatusSyngnamydia venezia, a novel member of the phylumChlamydiaefrom the broad nosed pipefish,Syngnathustyphle[J]. PLoS One, 2013, 8(8):1-8. DOI: 10.1371/journal.pone.0070853