硫酸头孢喹肟在安格斯牛体内药物代谢动力学研究

刘雪松，陈 亮，冯万宇，张 蕾，沈思思，兰世捷，李 丹，苗 艳，黄宝银，史同瑞

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005)

硫酸头孢喹肟(Cefquinome sulfate)，分子式为C23H24N6O5S2H2SO4，CAS号为118443-89-3，又称为硫酸头孢喹诺和硫酸头孢喹咪。硫酸头孢喹肟是动物专用第4代头孢菌素类药物，相比较于前3代头孢菌素类药物，具有更广的抗菌谱，更强的抗菌效果，以及对β-内酰胺酶具有更高的稳定性[1]。硫酸头孢喹肟优良的抗菌活性与其化学结构有着极大的关系。硫酸头孢喹肟带一个正电荷的四价季铵离子基团，而母核带负电荷，这种结果与前3代头孢菌素的结构不同。这一结构可以帮助硫酸头孢喹肟迅速穿过细胞膜，并且保证了其对β-内酰胺酶的高度稳定性[2]。许多报道表明，硫酸头孢喹肟对金黄色葡萄球菌、链球菌、致病性大肠杆菌以及多杀性巴氏杆菌等具有良好的敏感性。对治疗细菌引起的败血症、乳房炎以及子宫内膜炎等具有良好的效果[3]。硫酸头孢喹肟在多种动物上进行过药物代谢动力学研究，但是在安格斯牛体内的药物代谢动力学研究未见报道。试验为首次在安格斯牛体内进行的硫酸头孢喹肟药物代谢动力学研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 硫酸头孢喹肟注射液，批号：DLD210401，购自河北远征药业有限公司。硫酸头孢喹肟标准品，批号：G130285，购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。色谱级乙腈，批号：R141437，购自北京迪科马科技有限公司。分析级甲酸，批号：20171018，购自辽宁泉瑞试剂有限公司。

1.1.2 仪器 岛津LC 20-AT液相色谱仪、二级阵列管检测器、InertSustainC18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，购自日本岛津公司。TGL-16G高速离心机，购自上海安亭科学仪器厂。MD200-1氮吹仪，购自杭州奥盛仪器有限公司。涡旋振荡器，购自海门市其林贝尔仪器有限公司。

1.1.3 试验动物 安格斯牛6头，170～220 kg，雌性各半，7～8月龄，购自黑龙江省齐齐哈尔市周边肉牛养殖厂。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 根据相应参考文献，确定流动相为0.05%甲酸水和乙腈，体积比为90∶10。流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长为270 nm[4]。

1.2.2 样品前处理 将300 μL血浆，加入300 μL的1%甲酸乙腈，混合均匀后，用涡旋震荡1 min后，14000 r/min离心15 min，吸取上清，进行氮气吹干，温度为60 ℃。用300 μL流动相对吹干物质进行溶解，过膜后上机检测。

1.2.3 绘制标准曲线 对不含有任何药物的安格斯牛血浆进行处理，获得不含有任何药物的血浆基质，在80 μL无药物的血浆基质中添加20 μL相应浓度的硫酸头孢喹肟标准品溶液，均匀混合，使最终药物浓度分别为5、10、50、200、500、1000 ng/mL。分别将添加药物的样品进行高效液相色谱检测，绘制标准曲线。

1.2.4 方法学专属性 向80 μL不含有任何药物的血浆中添加20 μL相应浓度的硫酸头孢喹肟的标准液，使得药物最终浓度分别为50、500、1000 ng/mL。进行前处理后进行高效液相色谱药物浓度检测。将经过前处理的药物峰面积与标准曲线中的药物峰面积进行比较。做3个重复，3个批次，计算回收率、批内相对标准差以及批间相对标准差。根据信噪比S/N≥3时添加到无药血浆基质中的硫酸头孢喹肟的浓度作为检测限(LOD)，S/N≥10时添加到无药血浆基质中的硫酸头孢喹肟的浓度为定量限(LOQ)。

1.2.5 药动学设计 在给药开始前，采集未注射任何药物的安格斯牛血液，置于肝素钠无菌采血管中。经过离心后，获得无药物的空白血浆。将6头牛分为A、B两组。其中A组以2 mg/kg的剂量静脉注射硫酸头孢喹肟，B组以2 mg/kg的剂量皮下注射硫酸头孢喹肟。在给药后，两组牛在0.083、0.167、0.5、1、3、6、9、12 h进行颈静脉采血。静脉注射的牛在注射药物的对侧颈静脉采血。采血量为4 mL，置于含有肝素钠的无菌采血管中。采集的血液样品在3500 r/min、4 ℃条件下离心15 min，取上清，获得血浆样品。6头牛在经过2周的休药期后，随机选取3头牛以2 mg/kg的剂量进行肌肉注射，并按上述操作进行血浆样品的获取。

1.2.6 参数计算 药动学数据采用Winnonlin 5.2.1软件进行分析。采用非房室模型(Non-compartmental analysis,NCA)分析血浆中药物浓度-时间数据。计算肌肉注射的绝对生物利用度，以及皮下注射的绝对生物利用度，公式如下。

2 结果与分析

2.1 方法学专属性 硫酸头孢喹肟的出峰时间为16.8～17.2 min。在硫酸头孢喹肟标准品、硫酸头孢喹肟血浆添加样品以及采集的血浆样品中都无杂质峰干扰。无药物血浆色谱图、硫酸头孢喹肟标准品色谱图以及采集的血浆样品色谱图如图1所示。

a. 无药物血浆色谱图；b. 硫酸头孢喹肟标准品色谱图；c. 给药后采集血浆样品色谱图a. chromatogram of durg-free plasma sample; b. chromatogram of standard cefquinome sulfate sample. c. chromatogram of collected plasma sample after administration.图1 样品色谱图Fig 1 Chromatograms of cefquinome sulate

在50、500、1000 ng/mL的浓度下，硫酸头孢喹肟的回收率在82.35%～104.27%。批内相对标准偏差在1.73%～6.87%，批间相对标准偏差在3.69%～8.75%。根据信噪比S/N≥3时添加到无药血浆基质中的硫酸头孢喹肟的浓度，检测限(LOD)为10 ng/mL，根据信噪比S/N≥10时添加到无药血浆基质中的硫酸头孢喹肟的浓度，定量限(LOQ)为20 ng/mL。试验采用的高效液相色谱方法具有良好的方法学专属性。

2.2 标准曲线 标准曲线如图2所示，相关系数为0.9974，方程为Y=12960X+110486。说明标准曲线线性关系良好，标准曲线可用。

图2 标准曲线图Fig 2 Standard curve

2.3 药代动力学参数计算 药物-时间数据如表1所示。药物代谢动力学参数如表2及图3所示。具体药-时数据如表3所示。静脉注射后硫酸头孢喹肟在安格斯牛体内的药物代谢动力学参数如下：消除半衰期(T1/2β)为(2.05±0.49) h，达峰时间(Tmax)为(0.75±0.25) h，药时曲线下面积(AUC)为(24.72±5.31) μg·h/mL，达峰浓度(Cmax)为(7.31±1.98)μg/mL，平均滞留时间(MRT)为(2.83±0.61)h，清除率(CL)为(0.07±0.02)L/h·kg，表观分布容积(Vd)为(0.23±0.06)L/kg。肌肉注射后硫酸头孢喹肟在安格斯牛体内的药物代谢动力学参数如下：消除半衰期(T1/2β)为(2.17±0.51)h，达峰时间(Tmax)为(0.87±0.25)h，药时曲线下面积(AUC)为(19.97±3.11)μg·h/mL，达峰浓度(Cmax)为(5.34±1.21)μg/mL，平均滞留时间(MRT)为(3.02±0.71) h，清除率(CL)为(0.09±0.03) L/h·mLkg，表观分布容积(Vd)为(0.31±0.08)L/kg。皮下注射后硫酸头孢喹肟在安格斯牛体内的药物代谢动力学参数如下；消除半衰期(T1/2β)为(2.37±0.47) h，达峰时间(Tmax)为(1±0.37) h，药时曲线下面积(AUC)为(20.51±4.87) μg·mLh/mL，达峰浓度(Cmax)为(5.16±1.29) μg/mL，平均滞留时间(MRT)为(3.26±0.89) h，清除率(CL)为(0.09±0.04) L/h.kg，表观容积(Vd)为(0.32±0.09) L/kg。肌肉注射的绝对生物利用度(F)为80.78%。肌肉注射的绝对生物利用度(F)为82.96%。

表1 药-时数据Tab 1 Concentration-time data

表2 药动学参数Tab 2 Pharmacokinetic parameters

图3 药-时曲线图Fig 3 Concentration-time curve

3 讨论与结论

硫酸头孢喹肟的药物代谢动力学研究在多种动物上都有相关的报道。本次静脉注射后的消除半衰期(T1/2β)为2.05 h，与Ahmad在牛体内测定的2.1 h接近[5]，低于Dinakaran等在水牛体内测定的3.56 h[6]，低于Dumka等在山羊体内测定的5.76 h[7]，高于Cheng等在雏鸭体内测定的0.97 h，以及在雏鹅体内测定的1.73 h[8]。本次静脉注射后，硫酸头孢喹肟在安格斯牛体内的表观分布容积(Vd)为0.23 L/kg，略低于Ahmad在牛体内测定的0.28 L/kg[5]，低于宋永强在山羊体内测定的0.61 L/kg[9]，低于Cheng等在雏鹅体内测定的0.43 L/kg，高于在雏鸭体内测定的0.042 L/kg[8]。测得的血浆清除率(CL)为0.07 L/h·mLkg，与Dinakaran在水牛体内测定的0.06 L/h·mLkg相近[6]，低于Ahmad在牛体内的0.12 L/h·mLkg以及Zhao等在黑天鹅体内测定的0.13 L/h·mLkg[5,10]。静脉注射后的药时曲线下面积(AUC)为24.72 μg·h/mL，低于Dumka在山羊体内测定的33.83 μg·h/mL，高于Zhou等在比格犬体内测定的8.51 μg·h/mL[7,11]。测定的静脉注射后在安格斯牛体内的平均滞留时间(MRT)为2.83 h，低于Dinakaran在水牛体内测定的4.24 h[6]，低于Dumka在山羊体内测定的6.09 h[7]，高于Ahmad在牛体内测定的2.3 h[5]。研究中肌肉注射后的消除半衰期(T1/2β)为2.17 h，高于李冲在猪体内测定的1.98 h[12]，低于Dumka在山羊体内测定的5.86 h[7]，低于俞吉杰在肉鸭体内测定的5.76 h[13]。测定肌肉注射后，硫酸头孢喹肟在安格斯牛体内的表观分布容积(Vd)为0.31 L/kg，与Zhao等测定的静脉注射后在黑天鹅体内的0.32 L/kg相近，低于李冲在猪体内测定的0.71 L/kg[10,12]。肌肉注射后，硫酸头孢喹肟在安格斯牛体内的达峰浓度(Cmax)为5.34 μg/mL，与Zhang等在黑天鹅体内测定的5.71 μg/mL相近[10]，高于Dumka等在山羊体内测定的4.84 μg/mL[7]，高于Zhou在比格犬体内测定的4.84 μg/mL[11]。本次试验，肌肉注射的绝对生物利用度(F)达到了80.78%，高于Dumka等在山羊体内测定的57.39%[7]，高于Zhao在黑天鹅体内测定的74.2%[10]，低于Zhou等在比格犬体内测定的97.8%[11]。皮下注射后测定消除半衰期(T1/2β)为2.37 h，低于Corum等在绵羊体内测定的7.59 h[14]。达峰浓度(Cmax)为5.16 μg/mL，高于Zhou等在比格犬体内测定的3.88 μg/mL以及Corum等在绵羊体内测定的3.65 μg/mL[11,14]。根据欧盟药敏试验(EUCAST)标准的规定，流行病学折点值(Epidemiological cut-off，ECOFF)是协助药物临床使用折点制定的重要依据之一[15]。目前为止，根据EUCAST官网上已经公布的数据，头孢喹肟对于溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica)的ECOFF值为0.06 μg/mL。头孢喹肟对于多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)的ECOFF值为0.125 μg/mL。头孢喹肟对于275株大肠杆菌(Escherichiacoli)的MIC值皆为0.06 μg/mL。本次试验，无论哪种注射方式，安格斯牛血药浓度高于不同细菌ECOFF值的时间占比都较高，表明在现阶段头孢喹肟可以有效治疗相关疾病。

以往的研究认为，硫酸头孢喹肟的抗菌机制与其他头孢菌素类抗生素一样，都是通过竞争青霉素结合蛋白(Penicillin binding proteins，PBPs)抑制细菌细胞壁的形成，导致细菌死亡[16]。一些研究表明，除了以上的抗菌机制以外，头孢喹肟也可以干预细菌生物被膜的形成，从而减少细菌极端抗性的产生。生物被膜(Biofilm)附着在生物或者非生物表面上，是由细菌及其分泌的多种基质组成的细菌群落，是造成致病性细菌持续感染的重要原因之一，是维持细菌毒力及其耐药性的重要因素之一[17]。Zhou等建立了金黄色葡萄球菌生物被膜小鼠体内感染模型，并运用PK/PD同步模型得出了头孢喹肟达到不同生物被膜减少效果的所需的PK/PD指数值，得出头孢喹肟可以有效减少金黄色葡萄球菌生物被膜的形成[18]。周永辉证明了低于最小抑菌浓度(Minimal inhibit concentration，MIC)的头孢喹肟可以对木糖葡萄球菌生物被膜的形成起到干预作用。低于MIC的头孢喹肟可以降低咪唑甘油磷酸酯脱水酶(IGPD)的活性及组氨酸的生物合成，而且还可以与IGPD的组氨酸36、组氨酸63相结合，达到干预生物被膜的作用[19]。

除了经常使用的注射剂和粉针剂以外，许多新的硫酸头孢喹肟剂型被研制出来。杜新旋[20]研制出了纳米化硫酸头孢喹肟透皮剂，提高了硫酸头孢喹肟的渗透性，更加易于吸收，可以更加有效地在靶部位干预细菌生物被膜的形成，达到优良的抗菌效果。李德谦[21]研制出了硫酸头孢喹肟的长效注射剂型，具有良好的缓释作用，可以长效地抑制细菌生物被膜的形成。付强[22]研制出了硫酸头孢喹肟的脂质体制剂，有效提高了硫酸头孢喹肟的缓释作用，抗菌有效性以及肺靶向性。李辉[23]研制成功了硫酸头孢喹肟的乳膏剂，使硫酸头孢喹肟给药方式较为方便[23]。除此之外，乳房注入剂、微球以及微乳等剂型也已经研制成功。这些新剂型各具优势，可以有效提高硫酸头孢喹肟的利用率，并且可以有效提升硫酸头孢喹肟在靶部位对于细菌生物被膜形成的干预作用。目前，作为动物专用的头孢菌素类药物，硫酸头孢喹肟在临床上使用率较高。试验得出了硫酸头孢喹肟在安格斯牛体内的药动学参数，为硫酸头孢喹肟在安格斯牛的合理使用提供了数据，也为减少细菌对硫酸头孢喹肟的耐药性提供了试验依据。