食源性Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的研究进展

林善婷，胡 晓*，李来好，杨贤庆

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，广东 广州 510300；2.南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214081）

铁离子是构成人体组织和维持正常生理功能所必需的微量营养元素。作为血红素的组成成分，其参与氧气转运和储存，铁离子是过氧化氢酶、单胺氧化酶、细胞色素氧化酶等大多数酶的构成成分，它不仅参与机体细胞代谢，还可维持正常造血功能以及增强神经系统和免疫系统的功能，当体内缺乏铁离子时易导致贫血、缺乏食欲、生长迟缓，对于铁离子缺乏的孕妇易导致早产，增加母婴死亡风险等[1]。铁离子缺乏是世界上最常见且普遍的营养缺乏症。据世界卫生组织统计，在全球范围内，几乎一半的6～59 个月的儿童以及1/3的育龄妇女患有缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）症[2]。铁离子缺乏症可能由多种原因引起，如膳食铁离子摄入不足、铁离子生物利用度不高、某个时期（如女性孕期）对铁离子的需求量大等[3]。人体中的铁离子主要来源于日常膳食，而膳食中的许多谷物类主食，如玉米、大米和豆类，通常含有植酸、单宁、肌醇磷酸盐和多酚，易与铁离子结合，形成不溶于水的沉淀从而降低铁离子在体内的吸收[4]。此外，金属离子之间存在相互拮抗作用，能够降低铁离子生物利用度[5]。膳食钙可以以剂量相关的方式显著减少铁离子的吸收，即含有少量铁离子的高钙饮食个体会出现缺铁症[5]。过量的锌也会降低铁离子的吸收[6]。因此，为了增加铁离子的吸收量，弥补其在吸收过程中的损失，降低其缺乏病的发生率，常使用铁离子强化剂对食品进行铁离子强化，但常规铁离子强化剂由于性质不稳定而易导致食品的颜色、口味和品质特性发生不利的变化，造成胃肠道疾病[7]。如硫酸亚铁在加入婴儿谷物和可可粉[8]时会引起不可接受的颜色变化，在无麸质面包[9]中引起金属味和黏性变化等。

Fe2＋/Fe3＋结合活性肽是指具有结合铁离子活性的肽类物质，其与Fe2＋/Fe3＋结合后形成的肽-Fe2＋/3＋结合物，可提高铁离子在肠道中的溶解度，使铁离子通过二价金属离子转运体1（divalent metal transporter 1，DMT1）转入细胞内，或通过肽转运途径和胞吞作用将肽-Fe2＋/3＋结合物转运到细胞内，促进肠道对铁离子的吸收，进而起到补铁的作用；此外，肽-Fe2＋/3＋结合物具有转运速率快、稳定性高、不易被饱和、可减少金属间的拮抗作用等优点[10]。随着越来越多具有促进或增强铁离子生物利用度的Fe2＋/Fe3＋结合活性肽及肽-Fe2＋/3＋结合物被研究并鉴定，Fe2＋/Fe3＋结合活性肽及肽-Fe2＋/3＋结合物在铁离子缺乏的调控中已显示出潜在的应用价值。Fe2＋/Fe3＋结合活性肽及肽-Fe2＋/3＋结合物作为铁离子的膳食补充剂已成为研究的热点。

1 Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的来源

目前，根据现有的研究总结发现，Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的来源主要有植物蛋白源、陆生动物蛋白源以及水产蛋白源。植物性蛋白是日常膳食中最常见的优质蛋白质之一。Lü Ying等[11]利用大豆蛋白水解物经固定化金属亲和层析色谱（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）-Fe3＋分离出了富含Glu和Pro的Fe3＋结合活性肽Asp-Glu-Gly-Glu-Gln-Pro-Arg-Pro-Phe-Pro-Phe-Pro-Arg-Pro。Torres-Fuentes等[12]从鹰嘴豆蛋白水解物中分离出了His含量高、可增加Fe2＋溶解度和生物利用度的Fe2＋结合活性肽。Lü Ying等[13]利用核桃蛋白水解物，通过IMAC-Fe3＋分离出了核桃Fe3＋结合活性肽Leu-Ala-Gly-Asn-Pro-Asp-Asp-Glu-Phe-Arg-Pro-Gln和Val-Glu-Asp-Glu-Leu-Val-Ala-Val-Val。Budseekoad等[14]从绿豆蛋白水解物分离鉴定出了肽序列为Pro-Ala-Ile-Asp-Leu的Fe2＋结合活性肽。

陆生动物蛋白也是制备Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的良好来源。Storcksdieck等[15]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟体外胃肠道消化，对煮熟的牛肉、鸡肉、鳕鱼、羊肉和猪肉等肌原纤维蛋白进行酶解，分离出分子质量约为2 kDa且富含Glu和Asp的Fe2＋结合活性肽。Lee等[16]从猪血浆蛋白水解物中分离鉴定出了Fe2＋结合活性肽Asp-Leu-Gly-Glu-Gln-Tyr-Phe-Lys-Gly。Palika等[17]模拟体外胃肠消化，从蛋清蛋白中分离鉴定出了可结合Fe3＋的磷酸肽Asp-Lys-Leu-Pro-Gly-Phe-Gly-Asp-Ser(PO4)-Ile-Glu-Ala-Gln。纪晓雯等[18]利用酪蛋白酶解产物经IMAC及质谱（mass spectrometry，MS）法分离鉴定出了Fe2＋结合活性肽His-Ile-Gln-Lys-Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu-Arg、Ile-Thr-Val-Asp-Asp-Lys-His-Tyr-Gln-Lys和Thr-Arg-Leu-His-Pro-Val-Gln-Glu-Arg。Li Bo等[19]从鸭蛋蛋白的中性蛋白酶酶解产物中分离鉴定出Fe2＋结合活性肽Pro-Val-Glu-Glu和Arg-Ser-Ser。

除了利用陆生动植物蛋白制备活性肽外，以低值水产品或水产品加工副产物为原料制备活性肽也是目前研究的热点，可提高低值水产蛋白的利用率。Guo Lidong等[20-21]从阿拉斯加鳕鱼皮胶原蛋白的胰蛋白酶水解产物中分离出了可结合Fe2＋的三肽Ser-Cys-His以及Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly。相似地，Wu Wenfei等[22]从太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的胰蛋白酶水解物中分离鉴定出了Fe2＋结合活性肽Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg、Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg和Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Arg。林慧敏[23]从带鱼的蛋白水解产物分离出了可结合Fe2＋的三肽His-Tyr-Asp。Wu Haohao等[24]从鳀鱼肌肉蛋白的胰蛋白酶水解物中分离并表征了4 条Fe3＋结合活性肽Glu-Leu-Glu-Gly-Glu-Val-Asp-Ala-Glu-Gln-Lys、Glu-Gln-Asp-Thr-Ser-Ala-His-Leu-Glu-Arg-Met-Lys、Ser-(Gly)7-Leu-Gly-Ser-(Gly)2-Ser-Ile-Arg、Ile-(Glu)2-Leu-(Glu)3-Ile-Glu-Ala-Glu-Arg。Kim等[25]从螺旋藻蛋白水解物中分离鉴定了分子质量为802 Da的Fe2＋结合活性肽Thr-Asp-Pro-Ile(Leu)-Ala-Ala-Cys-Ile(Leu)。

对已分离鉴定出的食物蛋白源Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的氨基酸序列进行分析发现，植物蛋白源Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的肽链中基本上含有一个或多个Glu、Pro、Leu、Asp、Val等氨基酸。在陆生动物蛋白源Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的氨基酸序列中，与植物蛋白源Fe2＋/Fe3＋结合活性肽相比，相同的是二者基本上含有一个或多个Glu、Pro、Leu、Asp，不同的是陆生动物蛋白源Fe2＋/Fe3＋结合活性肽还富含Lys、His和Ser。水产蛋白源Fe2＋/Fe3＋结合活性肽与陆生动植物蛋白源Fe2＋/Fe3＋结合活性肽相比，其同样含有Glu、Pro、His，但水产蛋白源Fe2＋/Fe3＋结合活性肽还富含Gly，尤其是在鳀鱼Fe3＋结合活性肽[24]中，Glu和Gly含量占肽链氨基酸总数的60%及以上。由此可知，以上这些氨基酸在Fe2＋/Fe3＋结合活性中起着重要的作用。

2 Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的制备、分离及结构鉴定

2.1 Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的制备

酶解法是目前较为常用且获得生物活性肽安全有效的方法，酶解反应过程易控、条件温和、无有害物质产生，能制备特定的易于分离的活性肽[26]。目前常用的食品级别商业酶有风味酶、中性蛋白酶、Alcalase、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、α/β-胰凝乳蛋白酶、复合蛋白酶等。Lee等[16]利用风味酶酶解猪血浆蛋白，其酶解物的Fe2＋结合能力为质量浓度1 000 mg/L的酶解物，可溶性Fe2＋质量浓度为26.6 mg/L。Guo Lidong等[20]利用胰蛋白酶酶解鳕鱼皮胶原蛋白，酶解物经IMAC及反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatogram，RP-HPLC）纯化后得到Fe2＋结合活性肽，其Fe2＋结合率为（27.7±1.9）%。Wu Haohao等[24]以鳀鱼蛋白为原料，以水解度和Fe3＋结合率为指标，从6 种商业蛋白酶中筛选出胰蛋白酶为最佳酶，且酶解产物Fe3＋结合率的半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50）为（0.013±0.001）mg/mL。此外，在双酶系统中，Palika等[17]模拟体外胃肠消化，先后使用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解蛋清以制备可结合Fe3＋的磷酸肽，经过RP-HPLC纯化后的酶解产物，其Fe3＋的结合能力显著高于原始酶解产物。相似地，Torres-Fuentes等[12]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶对鹰嘴豆蛋白进行酶解，并从酶解产物中分离出了His含量高的Fe2＋结合活性肽，其经IMAC纯化后组分的Fe2＋结合能力是原始酶解产物的4.5 倍。

由上可知，胰蛋白酶是制备Fe2＋/Fe3＋结合活性肽最为常用的酶。不同的酶具有不同的酶切位点，酶解蛋白后产生的不同肽段表明其活性不同。胰蛋白酶作为肽链内切酶，主要作用于肽链中Arg或Lys残基的羧基端。因此，根据不同的原料，选择其最优的酶或酶组合来制备具有特定活性的目标肽。

2.2 Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的分离与结构鉴定

IMAC-Fe2＋/IMAC-Fe3＋分离色谱对Fe2＋结合活性肽和Fe3＋结合活性肽具有高选择性，在温和的非变性洗脱条件下使多肽与固定配体之间形成特异性可逆复合物，从而将目标组分与其他组分分开，是Fe2＋/Fe3＋结合活性肽纯化的第一阶段[27]。已有研究表明核桃蛋白[13]、乳清蛋白[28]、鳀鱼肌肉蛋白[24]、鳕鱼皮胶原蛋白[21]等水解物经IMAC-Fe2＋/IMAC-Fe3＋色谱分离后可获得Fe2＋/Fe3＋结合活性肽。超滤（ultrafiltration，UF）、离子交换色谱（ion-exchange chromatography，IEC）、凝胶色谱（gel filtration chromatography，GFC）等利用不同的分离原理对多肽进行中间阶段的分离。RP-HPLC具有分离速率快、纯度高的特点，能够用于多肽序列鉴定前的纯化。多肽被纯化后利用MS法来鉴定肽链的氨基酸序列，为人工合成多肽提供依据。Lü Ying等[11]利用UF、IMAC-Fe3＋、RP-HPLC及基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS/MS）从大豆蛋白水解物中分离出Fe3＋结合活性肽。核桃蛋白水解物依次经过IMAC-Fe3＋、GFC-HPLC、RP-HPLC和液相色谱电离串联质谱（liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）等纯化与鉴定的步骤后可获得Fe3＋结合活性肽[13]。Wu Haohao等[24]利用GFC、IMAC-Fe3＋、RP-HPLC、MALDI-TOF-MS/MS从鳀鱼蛋白水解物中分离鉴定出了Fe3＋结合活性肽。鳕鱼皮胶原蛋白水解物经过IMAC-Fe2＋、凝胶色谱-快速蛋白液相色谱（gel filtration chromatography-fast protein liquid chromatography，GFC-FPLC）、RP-HPLC及LC-ESI-MS/MS的纯化鉴定步骤后可获得Fe2＋结合活性肽[21]。

上述研究表明，Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的分离与结构的鉴定需将以上多个方法联合使用，精确的鉴定出活性肽的氨基酸序列，为后期人工合成活性肽并进一步探究合成肽的生物活性，进而为实现活性肽产品的产业化提供依据。

3 Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的结构特征

3.1 分子质量

不同分子质量的Fe2＋/Fe3＋结合活性肽，其结合Fe2＋/Fe3＋的活性不同。小分子质量的鳕鱼皮胶原蛋白水解物（345 Da）[20]和螺旋藻蛋白水解物（802 Da）[25]均显示出比其大分子质量的水解物更高的Fe2＋结合活性。鹰嘴豆蛋白水解产物中小分子质量（＜500 Da）的组分，其Fe2＋结合活性高于大分子质量的组分[12]。从猪血浆蛋白水解物中鉴定出的Fe2＋结合活性肽分子质量为1 055 Da[16]，从核桃蛋白水解物中分离鉴定的两条Fe3＋结合活性肽的分子质量分别为971.508 0 Da和1 357.648 0 Da[13]。然而，一些大分子质量的肽由于含有特殊氨基酸，且齿状区域的数量较多，可能具有更强的Fe2＋/Fe3＋结合能力[29]。来自鳀鱼肌肉蛋白的两种Fe3＋结合活性肽，其分子质量分别为7 594 Da和8 106 Da[24]。Seth等[30]发现大部分Fe2＋与大于10 kDa的鸡肌肉蛋白肽结合，只有10%的Fe2＋与小肽或氨基酸结合。

由此可知，大部分研究表明分子质量小于1 500 Da的多肽，Fe2＋/Fe3＋结合活性较高，但也有一些分子质量较大的多肽，其Fe2＋/Fe3＋结合活性也较高，因此，多肽分子质量的大小与Fe2＋/Fe3＋结合活性之间的关系还需进一步探究。

3.2 氨基酸组成

每个氨基酸都有两个有效的供体基团（氨基和羧基），它们可结合金属离子[31]。根据路易斯规则，充当路易斯酸的Fe2＋/Fe3＋可以与富含氧或富含氮的基团（路易斯碱）反应，Fe2＋会优先与含氮基团（如Arg和Asn）结合，而Fe3＋更倾向于与含氧基团结合，如Glu和Asp中的羧基和磷酸基团[32]。此外，氨基酸侧链上的R基团通过改变氨基和羧基的化学环境来影响铁离子结合物的形成，例如组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基参与Fe2＋/Fe3＋的结合[20]。肽链中的Glu、Asp、His、Ser和Cys被报道为可与Fe2＋/Fe3＋结合的氨基酸，即Ser的磷酸基、Asp和Glu的羧基、His的咪唑基以及肽链中的Cys都可与Fe2＋/Fe3＋结合[13]。Guo Lidong等[20]从鳕鱼皮胶原蛋白中分离鉴定出只含有His、Ser和Cys的Fe2＋结合活性肽（Ser-Cys-His）。纪晓雯等[18]分离出的酪蛋白Fe2＋结合活性肽富含Glu、Asp、Gln。鹰嘴豆蛋白水解物中的His含量与Fe2＋结合活性正相关[12]。甘蔗酵母蛋白水解产物经IMAC-Fe3＋分离后的组分比原来的组分显示出更高的His、Lys和Arg含量[33]。Budseekoad等[14]发现Pro-Ala-Ile-Asp-Leu与Fe2＋结合的能力可能与肽链中的Pro、Asp和Leu中的吡咯烷环、羧基和烷基的协同效应有关。

综上所述，大多研究显示具有Fe2＋/Fe3＋结合活性的肽链中基本都含有一个或几个Glu、Asp、His、Ser、Cys和Lys等氨基酸（表1）。

4 肽-Fe2＋/3＋结合物的形成及结合位点

Fe2＋/Fe3＋结合活性肽是一种具有结合Fe2＋/Fe3＋能力的肽类物质，其与Fe2＋/Fe3＋结合后形成肽-Fe2＋/3＋结合物。肽-Fe2＋/3＋结合物中铁离子主要来源于无机铁离子，如硫酸亚铁、氯化亚铁和氯化铁[10,28,34]。多肽是两性物质，其与铁离子的配位结合受反应时间、温度、pH值、底物反应比例等因素的影响，且肽链具有二级结构和立体空间结构，其发生配位结合反应后可能对肽链的构象产生影响。

4.1 影响肽-Fe2＋/3＋结合物形成的因素

肽与Fe2＋/Fe3＋的结合率及肽-Fe2＋/3＋结合物的稳定性受多种因素的影响。肽与Fe2＋/Fe3＋的结合反应是配位体取代水分子的快速反应，通常在室温条件下，40～60 min内即可反应完全[35-36]。而在一定酸碱性范围内，随着pH值升高，肽与Fe2＋/Fe3＋结合率升高，当pH＞7时结合率降低，即结合反应的最佳pH值为5～6[35]。因为在酸性条件下，H＋易与Fe2＋/Fe3＋竞争供电子基团，不利于肽-Fe2＋/3＋结合物的生成。而在碱性条件下，羟基易与供电子基团争夺Fe2＋/Fe3＋而形成氢氧化物沉淀；此外，肽与Fe2＋/Fe3＋的比例也会影响肽-Fe2＋/3＋结合物的量，当溶液中Fe2＋/Fe3＋的浓度超过多肽的负载能力时，未与多肽结合的Fe2＋/Fe3＋因水解而导致铁氢氧化物沉淀的产生，同时会吸附一部分肽-Fe2＋/3＋结合物并与之共同沉淀[35]。Palika等[17]发现源自蛋清蛋白的合成肽Asp-Lys-Leu-Pro-Gly-Phe-Gly-Asp-Ser(PO4)-Ile-Glu-Ala-Gln，其Fe3＋结合活性以剂量依赖性增加，并且以1∶1的物质的量之比饱和。酪蛋白肽与FeCl2·4H2O的质量比例为4∶1时，形成肽-Fe2＋结合物的数量最多[18]。在花椒籽蛋白肽-Fe2＋结合物[35]和鳕鱼皮胶原蛋白肽-Fe2＋结合物中[36]，多肽与FeCl2结合的最佳质量比例分别为2.5∶1和4∶1。段秀等[37]研究发现在罗非鱼胶原蛋白肽与Fe2＋结合反应中，肽与Fe2＋的最佳质量比例为500∶1。原洪等[35]利用单因素试验与正交试验研究发现影响花椒籽多肽与Fe2＋结合率的因素从高到低为：pH值＞肽与FeCl2质量比＞温度＞时间。此外，李玉珍等[38]利用单因素试验及Box-Behnken响应面优化技术研究发现，花生粕蛋白多肽与Fe2＋的最佳结合条件为：m多肽∶在此条件下肽与Fe2＋的结合率为（85.68±1.27）%。

表1 Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的来源、制备条件及氨基酸序列Table 1 Sources, preparation conditions and amino acid sequences of Fe2＋/Fe3＋chelating peptides

由上总结发现，不同的原料制备出不同的Fe2＋/Fe3＋结合活性肽，其与Fe2＋/Fe3＋的最佳结合条件也会有差异，尤其是在肽与Fe2＋/Fe3＋的结合比例上差异较大。

4.2 肽-Fe2＋/3＋结合物的结合位点和结构变化

紫外-可见光谱（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-vis）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform-infrared spectroscopy，FTIR）、MS以及核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等技术常用来分析肽-Fe2＋/3＋结合物的结合位点以及肽-Fe2＋/3＋结合后结构的变化。Huang Guangrong等[39]通过FTIR发现虾加工副产物水解产物的Fe2＋结合的位点主要对应于羧酸酯基团，在较小程度上对应于肽键。Chen Qianru等[40]研究利用MS/MS技术发现Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly中His的咪唑环可能是潜在的Fe2＋结合位点。Eckert等[34]利用MS/MS分析发现，Ser-Val-Asn-Val-Pro-Leu-Tyr中的Val和Leu参与了Fe2＋结合，Pro残基没有直接参与Fe2＋的结合，而是使肽链弯曲形成结合环，肽链中的-Val-Pro-Leu和Tyr残基可能是Ser-Val-Asn-Val-Pro-Leu-Tyr的Fe2＋结合位点。林慧敏[23]利用NMR及FTIR结构表征显示，肽链His-Tyr-Asp中的—NH—、—NH2以及末端—COOH上的C＝O及—OH与Fe2＋发生结合，形成不稳定的结合物。肽与Fe2＋/3＋发生结合反应后，可能会引起肽链结构的变化，Wu Haohao等[41]发现鳀鱼蛋白铁离子结合活性肽myosin1116-1127侧链的羧基是Fe3＋的结合位点，即肽链羧基结合Fe3＋形成COO-Fe，再水解形成COO-Fe(OH)n，最后脱水缩合完成晶体生长，该过程中肽链的氢键体系遭到破坏，二级结构由β-折叠变为无规卷曲。段秀等[37]也发现罗非鱼皮胶原蛋白肽与Fe2＋结合后，荧光强度降低，即肽与Fe2＋的结合过程中伴随着肽链的折叠，相似的结果在鳀鱼多肽与Fe3＋的结合过程中也有发现[24]。

综上，Fe2＋/Fe3＋结合活性肽中Fe2＋/Fe3＋的结合位点主要是羧基与羰基等含氧基团、氨基等含氮基团以及His的咪唑基，肽链与Fe2＋/Fe3＋结合过程伴随肽链折叠等结构的变化（表2）。

表2 肽-Fe2＋/3＋结合物的结合条件及结合位点Table 2 Chelating conditions and sites of peptide-Fe2＋/3＋complexes

5 Fe2＋/Fe3＋结合活性肽与肽-Fe2＋/3＋结合物的生物活性

5.1 促进Fe2＋/Fe3＋的吸收

Caco-2细胞模型常用于评估Fe2＋/Fe3＋的体外吸收研究。Garcia-Nebot等[43]研究证明了β-CN（125）4P、αs1-CN（64-74）4P和αs2-CN（1-19）4P肽可增加Caco-2细胞中铁蛋白的合成。Chen Qianru等[40]发现源自鳕鱼皮的Fe2＋结合活性肽Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly在Caco-2细胞中可促进Fe2＋的转运。Palika等[17]研究发现人工合成的蛋清Fe3＋结合活性肽Asp-Lys-Leu-Pro-Gly-Phe-Gly-Asp-Ser(PO4)-Ile-Glu-Ala-Gln增加了Fe3＋在Caco-2细胞中的摄取量并刺激Caco-2细胞中铁蛋白的合成。Wu Haohao等[10]研究发现鳀鱼肌肉蛋白肽-Fe3＋结合物通过肽转运途径以及DMT1途径促进Caco-2细胞对Fe2＋/Fe3＋的吸收。Caco-2细胞模型用于研究Fe2＋/Fe3＋结合活性肽及肽-Fe2＋/3＋结合物的体外促进Fe2＋/Fe3＋吸收效果，而IDA大鼠模型则用于评估肽-Fe2＋/3＋结合物在动物体内的生物利用度。研究发现鸭蛋蛋白肽-Fe2＋结合物[19]可使IDA大鼠的体质量、器官系数和血液学参数恢复到正常水平，上调铁调节蛋白（hepcidin，Hepc）的表达，并通过下调细胞顶膜的Fe2＋转运蛋白DMT1以及细胞基底膜的铁转运蛋白的表达来调节铁离子代谢，表明DPs-Fe2＋可作为潜在的Fe2＋补充剂。此外，Fe2＋-β酪蛋白磷酸肽也被证实可提高缺铁大鼠体内Fe2＋的净吸收量[44]。

在比较肽-Fe2＋/3＋结合物与其他补铁产品的促铁吸收效果中，Eckert等[34]研究发现大麦蛋白肽-Fe2＋结合物与FeSO4相比，可显著增加Caco-2细胞对Fe2＋摄取量，且经胃蛋白酶-胰酶消化后的Ser-Val-Asn-Val-Pro-Leu-Tyr-Fe2＋结合物可使Caco-2细胞对Fe2＋的摄取量提高4 倍。相似地，乳清蛋白经体外模拟胃肠道消化后，小分子质量的肽与Fe2＋形成的结合物与FeSO4相比，其在Caco-2细胞中的Fe2＋摄取量增加了约70%[28]。同时，Ma Xiaoming等[45]通过构建IDA大鼠评价模型发现鳕鱼骨骼蛋白肽-Fe2＋结合物不仅可使IDA大鼠的体质量、身高和血液参数恢复到正常水平，且其与FeSO4相比还能更有效地改善IDA大鼠的血红蛋白、血清铁离子和转铁蛋白的水平，恢复铁离子与转铁蛋白的结合能力。Xiao Chen等[46]研究发现高剂量的Arg-Glu-Glu-Fe2＋与FeSO4、Fe-Gly相比，可显著提高IDA大鼠的肾系数、总铁结合能力、上调转铁蛋白水平以及肝脏中Hepc信使RNA的表达水平，并且与正常对照组相比无显著性差异。此外，还有研究发现在体内灌流的大鼠肠环模型中，源于β-酪蛋白的酪蛋白磷酸肽-铁结合物的吸收效果优于葡萄糖酸铁[47]。上述研究结果表明，肽-Fe2＋结合物是比FeSO4、Fe-Gly和葡萄糖酸铁更为有效的铁离子补充剂。

尽管Fe2＋/Fe3＋结合活性肽及肽-Fe2＋/3＋结合物在Caco-2细胞实验及IDA大鼠实验中均显示出促进Fe2＋/Fe3＋的吸收，但若要将其制成商品化的膳食Fe2＋/Fe3＋补充剂，还需研究其在人体中确切的吸收机制及吸收利用效果。已有研究表明，蛋白质、氨基酸[48]以及肉在消化过程中可生成含Cys的肽，其对人体Fe2＋的吸收有促进作用[49]。Martinez-Torres等[50]发现当Cys与植物性食物摄入时，非血红素铁在人体中的吸收有所增强。Layrisse等[48]研究了His、Cys、谷胱甘肽和牛肉对人体Fe2＋吸收的影响，结果发现还原型谷胱甘肽显著增加了黑豆和玉米中非血红素以及血红蛋白中血红素Fe2＋的吸收；此外，Cys、谷胱甘肽对玉米中Fe2＋的吸收增强作用与牛肉相似。然而，Pizarro等[51]研究发现动物源蛋白质及其消化产物不会增强人体血红素Fe2＋的吸收。因此，Fe2＋/Fe3＋结合活性肽及肽-Fe2＋/3＋结合物在人体中如何促进Fe2＋/Fe3＋的吸收有待进一步深入研究。

5.2 其他活性

Fe2＋/Fe3＋结合活性肽及肽-铁结合物的主要作用是促进铁离子在人体中的吸收，除此之外，它们还具有抗氧化、抗菌、免疫调节等活性。在Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的活性研究中，赵聪等[52]研究发现灰树花蛋白Fe2＋结合活性肽具有清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羟自由基的能力，随着活性肽质量浓度的增加，其自由基的清除率明显增加，在活性肽质量浓度为4 mg/mL时，其DPPH自由基和羟自由基的清除率分别高达92%和99.5%，且活性肽对于DPPH自由基的清除能力高于VC溶液。在肽-铁结合物的活性研究中，林慧敏[23]研究发现带鱼下脚料水解物的Fe2＋结合物具有抗菌活性，可抑制金黄色葡萄球菌对数生长期的菌体分裂，影响细菌细胞膜的渗透性，抑制金黄色葡萄球菌肠毒素A的分泌。Kholnazarov等[53]发现Ile-Trp-Fe2＋结合物具有免疫调节作用。此外，Zhang Bin等[54]研究发现，饲喂了400～1 000 mg/kg带鱼蛋白水解物-Fe2＋结合物的克氏原螯虾，其成活率、增质量比例、比生长率、肌肉指数以及血清和肝胰脏中的超氧化物歧化酶、酚氧化酶、溶菌酶和酸性磷酸酶的活力与对照组相比均显著提高，即PH-Fe2＋可作为克氏原螯虾饲料的补充剂，以促进生长和增强免疫力。在活性肽与肽-铁结合物的活性比较中，Blat等[55]研究发现Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Fe2＋结合物具有抗氧化活性，可抑制铁催化的羟自由基的形成和脂质过氧化，其保护人神经母细胞瘤细胞免受过氧化氢细胞毒性作用的效果优于原多肽。林慧敏等[56]发现4 种低值鱼蛋白酶解肽没有抑菌活性，而经与Fe2＋结合后形成的Fe2＋结合物表现出不同程度的抑菌作用。此外，杨玉蓉等[42]研究发现小分子质量（＜5 000 Da）的桃仁多肽-Fe2＋结合物抑菌活性高于大分子质量的，且桃仁多肽-Fe2＋结合物和小麦多肽-Fe2＋结合物对大肠杆菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）均为5.0 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC分别为2.5 mg/mL和5.0 mg/mL，该研究还发现桃仁、大豆、玉米和小麦等多肽-Fe2＋结合物的抗菌活性均高于原多肽，据此推测桃仁多肽Fe2＋结合物的抑菌活性与Fe2＋的抑菌活性有关。

6 肽-Fe2＋/3＋结合物促进Fe2＋/Fe3＋吸收的机制

6.1 提高并保持Fe2＋/Fe3＋的溶解度

所有的营养素均需要处于溶解的状态才会被细胞吸收利用。然而，日常膳食中通常含有Fe2＋/Fe3＋吸收抑制剂，如植酸、单宁、草酸盐和多酚等，它们可结合铁离子形成沉淀而降低Fe2＋/Fe3＋在肠道中的溶解度[57]。此外，肠腔中的环境是碱性的，Fe2＋/Fe3＋在pH＞3时会形成沉淀。多肽可以结合Fe2＋/Fe3＋形成可溶性的肽-Fe2＋/3＋结合物，使Fe2＋/Fe3＋在小肠中保持可溶状态。Wu Haohao等[41]研究发现，鳀鱼多肽介导的Fe3＋纳米微粒的形成可提高Fe3＋在溶液中的溶解度。Fe2＋-CPP结合物的形成也提高了Fe2＋在消化道中的溶解度。先后经过胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解后的蛋清蛋白，其酶解产物与Fe2＋的结合产物同样增加了Fe2＋在溶液中的溶解度[17]。蛋白酶解物或肽与Fe2＋/Fe3＋结合后使Fe2＋/Fe3＋以溶解的状态进入肠道，进而被肠细胞以胞吞形式、肽转运途径或通过胞膜上的离子通道将Fe2＋/Fe3＋摄入肠细胞。

6.2 通过多种途径促进Fe2＋/Fe3＋的吸收

目前，相关研究发现肽-Fe2＋/3＋结合物中的Fe2＋/Fe3＋可能通过寡肽转运体PepT1/PepT2、胞吞和离子通道等途径进入肠细胞。研究发现用Fe-Gly饲喂的仔猪，其十二指肠和空肠中PepT1的mRNA表达水平高于饲喂FeSO4的仔猪，从而表明PepT1在Fe-Gly的吸收中起关键作用[58]。CPP-Fe2＋结合物可通过胞吞作用被吸收[59]。人体内的Fe3＋需经还原性物质，如十二指肠细胞色素b（duodenal cytochrome B，Dcytb）以及肠细胞中其他还原酶将Fe3＋还原为Fe2＋后才能发挥其生理活性[60]。Cys和还原型谷胱甘肽增强了Caco-2细胞中Fe3＋的吸收，但对Fe2＋的吸收没有影响，这表明它们可能通过还原Fe3＋来促进铁离子的吸收[61]。同样地，Wu Haohao等[10]研究发现Caco-2细胞通过非特异性、非吸附性的胞吞作用来转运鳀鱼多肽-Fe3＋结合物，并发现肠细胞膜上的Dcytb还原酶可将Fe3＋还原为Fe2＋，Fe2＋再通过肠细胞膜上的Fe2＋转运蛋白DMT1转运至细胞内，进而促进Fe2＋/Fe3＋的吸收。

综上，Fe2＋/Fe3＋结合活性肽及肽-Fe2＋/3＋结合物促进Fe2＋/Fe3＋吸收的机制为（图1）：Fe2＋/Fe3＋结合活性肽结合Fe2＋/Fe3＋后可提高并保持Fe2＋/Fe3＋在肠道中的溶解度，当Fe2＋/Fe3＋结合活性肽是小分子寡肽时，小分子寡肽结合Fe2＋/Fe3＋后可能通过PepT1/PepT2途径将肽-Fe2＋/3＋结合物转入胞内；当较大分子质量的活性肽结合Fe2＋，即形成肽-Fe2＋结合物时，肽-Fe2＋结合物以胞吞的形式或通过胞膜上的Fe2＋转运蛋白DMT1将Fe2＋摄入细胞内；当结合的是Fe3＋时，肽-Fe3＋结合物以胞吞的形式进入肠细胞后，Fe3＋可经胞内的还原性物质还原为Fe2＋，或者肠细胞膜上的Dcytb还原酶将肽-Fe3＋结合物中Fe3＋的还原为Fe2＋后，再通过Fe2＋转运蛋白DMT1进入细胞内，从而促进Fe2＋的吸收。

图1 肽-Fe2＋/3＋结合物促进Fe2＋/Fe3＋吸收的机制Fig.1 Mechanism of peptide-Fe2＋/3＋complexes for promoting iron absorption

7 结 语

目前，对于Fe2＋/Fe3＋结合活性肽的研究主要是酶解制备、序列鉴定以及基础活性，而研究鲜少关注于肽与Fe2＋/Fe3＋反应的过程表征。尽管有许多研究利用UV-vis和FTIR推测出Glu、Asp、His等在肽链与Fe2＋/Fe3＋结合过程中起重要作用，但其确切的结合位点及结合后结构的变化尚不清楚，应进一步利用MS或分子对接技术对肽与Fe2＋/Fe3＋的结合位点进行准确的定位，对其结合后的结构变化进行表征。肽-Fe2＋/3＋结合物促进Fe2＋/Fe3＋吸收的机制大多只研究肽转运途径，鲜有从Fe2＋/Fe3＋细胞膜蛋白转运通道等其他途径进行探究，应进一步明确肽-Fe2＋/3＋结合物中Fe2＋/Fe3＋在肠细胞上的吸收通路。此外，肽-Fe2＋/3＋结合物还面临着如何维持其自身稳定性以及在胃肠道中的稳定性等关键性问题。Fe2＋/Fe3＋补充剂在长期贮存和加工过程中可能会发生许多未知的变化，如铁酪蛋白琥珀酰化液体口服制剂在长期贮存后会产生不可接受的味道[62]。因此，需进一步研究肽-Fe2＋/3＋结合物与不同食物基质的相容性，以及其在胃肠道消化或长期贮存过程中的稳定性。目前，尽管大多数Fe2＋/Fe3＋结合活性肽或肽-Fe2＋/3＋结合物已被证明对动物或细胞具有促进Fe2＋/Fe3＋吸收作用，但还亟需进一步确认其在人体中的实际应用效果。

多肽可作为营养素，为人体提供所需的氨基酸，其与Fe2＋/Fe3＋结合后还可促进非血红素Fe2＋/Fe3＋的吸收，减少Fe2＋/Fe3＋缺乏症的危害。此外，Fe2＋/Fe3＋结合活性肽及肽-Fe2＋/3＋结合物的原料大多是食物蛋白质，原料来源安全且资源丰富，既能充分利用蛋白资源还能避免浪费和环境污染。随着研究的深入，Fe2＋/Fe3＋结合活性肽及肽-Fe2＋/3＋结合物作为促铁离子吸收剂将具有广阔的应用前景。