臭氧微纳米气泡处理对菠菜采后保鲜的影响

王雪青，左进华，闫志成，史君彦，王 清,*，关文强

（1.北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业农村部蔬菜产后处理重点实验室，果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，农业农村部都市农业（北方）重点实验室，北京 100097；2.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

微纳米气泡是当下研究的热点，其由微米气泡和纳米气泡组成，其中微米气泡直径小于50 μm，纳米气泡直径小于1 μm，因气泡体积极其细微，所以在水中受到的浮力小，上升速率缓慢[1]。微纳米气泡比表面积大，气体溶解能力强[2]，宽pH值范围内表面携带负电荷，强酸性条件带正电荷[3]，电荷与周围离子形成双电层，所以气泡表面存在电势差即ζ电位[4]，这种高电位在气泡破裂时产生冲击波促进水分解产生羟自由基[5]。羟自由基是由微纳米气泡产生的外源活性氧（reactive oxygen species，ROS），中等水平的ROS具有生理促进和氧化作用[6]。微纳米气泡在水中的稳定性与ζ电位有关，它可阻碍气泡间的聚集[7]，也与气泡所受浮力有关[5]。因此微纳米气泡可悬浮数月，延长了气体在水中停留的时间。

臭氧作为一种强氧化剂，可以氧化呼吸代谢释放的乙烯、乙醇等气体，并具有杀菌特性，在果蔬采后保鲜方面得到广泛应用[8-9]。臭氧在水中不稳定、易分解[10]，与微纳米气泡结合可增加水中溶解量，通过连续鼓泡供应维持其浓度恒定[11-12]。目前臭氧微纳米气泡（ozone micro-nano-bubbles，Ozone MNBs）在果蔬应用方面有一定的研究进展，He Huaming等[11]以蒸馏水为对照，采用2.3 mg/L Ozone MNBs处理番茄赤星病菌分生孢子悬浮液5 min，孢子数量减少3.5 个数量级，并且该质量浓度喷洒番茄植株未对其生长造成不利影响，可用于生长过程中的病菌防治。张慧娟等[13]指出与传统机械振动清洗相比，Ozone MNBs洗涤降低了对叶类蔬菜的损伤。这些已有研究主要针对Ozone MNBs的微生物杀菌和清洗作用开展，缺乏对果蔬生理指标的探究。在Lee等[14]臭氧微米气泡对栗子具有保鲜效果启发下，以He Huaming[11]和张慧娟[13]等的研究为基础，通过生理指标探究Ozone MNBs是否具有低机械伤蔬菜保鲜作用。

菠菜（Spinacia oleraceaL.）水分含量高，富含维生素、矿物质等多种营养素[15]。新鲜的菠菜叶面面积大、气孔多[16]，呼吸作用和酶活性均处于较高水平[17]，并且叶片和叶茎部位十分脆弱，处理过程中易受伤。所以本实验以菠菜为材料，以1～10 mg/L质量浓度范围内Ozone MNBs对其进行预实验，多次重复实验证实质量浓度为4 mg/L时处理的菠菜感官评分最高。因此，本实验研究（20±1）℃贮藏条件下，4 mg/L Ozone MNBs处理对菠菜采后保鲜的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菠菜采购于北京超市发连锁有限公司，选择新鲜、无机械伤、无病虫害的菠菜进行实验。

三氯乙酸 天津百奥泰科技发展有限公司；2-硫代巴比妥酸 国药集团化学试剂有限公司；丙酮、乙醇、硫酸 北京科创顺达科技有限公司；四水合钼酸铵、磷酸氢二钠 西陇化工股份有限公司；草酸、乙二胺四乙酸、偏磷酸、乙酸 天津市科密欧化学试剂有限公司；愈创木酚、体积分数30%过氧化氢 南开大学精细化学实验厂。

1.2 仪器与设备

3S-T臭氧发生器 北京同林科技有限公司；MF-5000微纳米气泡发生装置 上海行恒科技有限公司；CR-300色差计 日本柯尼卡美能达公司；GXH-3051呼吸机 北京均方理化科技研究所；7820A乙烯机美国安捷伦科技有限公司；D-37520离心机 北京诚茂兴业科技发展有限公司；DDS-307A电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-1800紫外分光光度计日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

两种处理：一组为Ozone MNBs组，将臭氧发生器接通在微纳米气泡发生装置上对其连续供应臭氧，对300 L蒸馏水充气，控制臭氧质量浓度为4 mg/L，将菠菜浸泡在Ozone MNBs中处理5 min；一组为CK组，未通入Ozone MNBs，其他条件相同。处理后的菠菜表面晾干后装入0.03 mm厚聚乙烯袋折口存放，每袋10 棵，3 次重复共48 袋。置于（20±1）℃库贮藏，从0 d开始每隔2 d进行感官评价和取样测定。取样时，将整棵菠菜切碎，放入液氮冷冻，再将样品存放于-80 ℃冰箱中，用于后期生理指标的测定。

1.3.2 感官评价

感官评分采用徐冬颖等[17]的方法，经过培训的6 人依据对菠菜的色泽、腐烂程度等特征进行评价，采用9 分制。评分标准如表1所示，结果取平均值。

表1 菠菜感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of spinach

1.3.3 黄化指数和色差的测定

黄化指数测定采用徐静等[18]的方法并稍作修改，依据菠菜叶片的黄化面积对其分级，0级，黄化面积率为0；1级，黄化面积率≤25%；2级，25%＜黄化面积率≤50%；3级，50%＜黄化面积率≤75%；4级，黄化面积率＞75%。黄化指数按式（1）计算，结果取平均值。

色差采用色差计测量，每组随机选取3 个叶片，叶片正反面各取3 个点，测定其L*、a*、b*值，结果取平均值。

1.3.4 细胞膜渗透率和丙二醛含量的测定

细胞膜渗透率采用张乙博等[19]的方法测定，称取2.0 g叶肉圆片，加入20 mL去离子水浸泡，采用电导率仪测定初始去离子水电导率（P0/（μS/cm））。轻轻振荡10 min，记录此时电导率（P1/（μS/cm））。放入沸水浴煮沸10 min，冷却后加水至原刻度，记录最大电导率（P2/（μS/cm））。细胞膜渗透率按式（2）计算。

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法[20]测定，称取1.0 g样品，加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，于4 ℃、13 000×g离心20 min，收集2.0 mL上清液于试管中。向试管加入2.0 mL 6.7 g/L硫代巴比妥酸溶液，沸水浴煮沸20 min，冷却后再次离心，测定其在波长450、532 nm和600 nm处吸光度。

1.3.5 呼吸强度和乙烯释放量的测定

呼吸强度采用张引引等[21]的方法测定，呼吸机预热30 min，将菠菜放入封密性良好的呼吸室，置于（20±1）℃贮藏库。30 min后记录CO2释放量，之后每隔10 min记录一次，共记录3 次。呼吸强度以单位时间内每千克果蔬在呼吸过程中释放的CO2的质量表示，单位为mg/（kg·h）。

乙烯释放量采用曹建康等[22]的方法测定，菠菜放入密封盒中，置于（20±1）℃贮藏库。1 h后抽取三针气体，利用气相色谱仪测定乙烯释放量。

1.3.6 叶绿素含量和VC含量的测定

叶绿素含量采用Shi Junyan等[23]的方法并稍作修改。该实验在避光条件下进行，称取0.5 g样品，加入6.0 mL丙酮和乙醇混合液（2∶1，V/V）提取，于4 ℃、13 000×g离心10 min，取上清液测定其在663 nm和645 nm波长处的吸光度。

VC含量采用钼酸铵比色法[24]测定，称取1.0 g样品，加入5.0 mL 0.05 mol/L 草酸-0.2 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液，于4 ℃、13 000×g离心10 min，收集2.0 mL上清液于试管中，向试管加入3.0 mL草酸-EDTA、0.5 mL体积分数30%偏磷酸-乙酸、1.0 mL体积分数5%硫酸和2.0 mL 5 g/100 mL钼酸铵溶液，摇匀放于80 ℃恒温水浴锅保持10 min，冷却后加蒸馏水定容至10 mL，测定在760 nm波长处吸光度。

1.3.7 过氧化氢含量的测定

过氧化氢含量采用陈拓等[25]的方法测定，称取2.0 g样品，加入2.0 mL预冷的丙酮，于4 ℃、13 000×g离心20 min，取1.0 mL上清液于试管中。向试管加入0.2 mL浓氨水和0.1 mL体积分数20%四氯化钛，再次离心，弃去上清液，用冷丙酮洗涤沉淀至除去色素，向沉淀中加入3.0 mL 2 mol/L硫酸溶解，于508 nm波长处测定吸光度。

1.3.8 过氧化物酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶活力的测定

称取1.0 g样品，加入5.0 mL 0.1 mol/L pH 7.8磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（含质量分数0.5%聚乙烯吡咯烷酮），于4 ℃、13 000×g离心30 min，得到上清液，即酶提取液。

过氧化物酶（peroxidase，POD）活力采用愈创木酚法[26]测定。取0.1 mL酶提取液于试管中，向试管加入1.0 mL PBS、0.9 mL 0.2%（体积分数，后同）愈创木酚和1.0 mL 0.3% H2O2溶液，迅速混匀倒入比色皿，置于分光光度计样品室，测定反应体系在470 nm波长处的吸光度。

过氧化氢酶（catalase，CAT）活力采用Platt-Aloia等[27]的方法测定。取0.1 mL酶提取液于试管，再向试管中加入1.9 mL PBS和1.0 mL 0.3% H2O2溶液，迅速混匀倒入比色皿中，置于分光光度计样品室，测定体系在240 nm波长处的吸光度。

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力采用Wang Qing等[28]方法测定。称取1.0 g样品，加入5.0 mL 0.1 mol/L pH 7.5 PBS（含0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L 抗坏血酸、质量分数2%聚乙烯吡咯烷酮），于4 ℃、13 000×g离心20 min，收集0.1 mL酶提取液于试管中。向试管加入2.6 mL PBS（含0.1 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L抗坏血酸）和0.3 mL 2 mmol/L H2O2溶液，迅速混匀倒入比色皿，利用分光光度计测定反应体系在290 nm波长处的吸光度。

以每克鲜质量样品每分钟吸光度增加1为1 个POD活力单位；以每克鲜质量样品每分钟吸光度减少0.01为1 个CAT、APX活力单位。

1.4 数据统计与分析

采用EXCEL 2016软件进行数据整理，利用SPSS 19.0软件对数据进行Duncan’s差异显著性分析（P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著）。运用Origin 2017软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 Ozone MNBs处理对菠菜感官品质的影响

图1 Ozone MNBs处理对菠菜感官品质的影响Fig.1 Effect of ozone MNB treatment on sensory quality of spinach

感官评分是对菠菜色泽、新鲜度和腐败程度等外观品质最直接的评价。由图1可知，随着贮藏时间的延长，菠菜感官品质呈下降趋势，且4～8 d时Ozone MNBs组菠菜的品质显著高于CK组（P＜0.05）。这是因为微纳米气泡粒径极小，能深入清洗果蔬缝隙等狭小空间[29]，并且气泡在破裂瞬间激发产生大量ROS，臭氧在ROS辅助下增强了对表面附着污染物的氧化分解效果[30]，所以经Ozone MNBs处理的菠菜色泽鲜亮、腐败程度低。表明Ozone MNBs处理可有效维持菠菜的感官品质。

2.2 Ozone MNBs处理对菠菜黄化指数和色差的影响

图2 Ozone MNBs处理对菠菜黄化指数的影响Fig.2 Effect of ozone MNB treatment on yellowing index of spinach

果蔬在采后贮藏期间易发生黄化现象，这与果蔬的衰老、叶绿素降解和乙烯对色素代谢调控等多种因素有关[31]。图2显示，两种处理的菠菜叶片黄化程度随贮藏时间的延长呈上升趋势。贮藏4 d后，叶片黄化速率加快，Ozone MNBs组菠菜黄化指数虽低于CK组，但两组的差异并不显著（P＞0.05）。

表2 Ozone MNBs处理对菠菜色差的影响Table 2 Effect of ozone MNB treatment on color difference of spinach

可通过亮度L*值和色度a*值（正负表示偏红绿）、b*值（正负表示偏黄蓝）来表示样品的色泽[32]。由表2可知，贮藏过程中Ozone MNBs组L*、a*值显著低于CK组（P＜0.05），表明经Ozone MNBs处理的菠菜色泽明亮且偏绿，这是因为气泡对菠菜表面进行了深度清洗，与感官评价结果一致。两个组b*值随贮藏时间延长呈先降低后升高趋势，且Ozone MNBs组菠菜的b*值始终低于CK组，且6～8 d时差异显著（P＜0.05），说明臭氧微纳米处理后的菠菜叶片黄化程度低，与黄化指数结果相符合。

2.3 Ozone MNBs处理对菠菜细胞膜渗透率和丙二醛含量的影响

图3 Ozone MNBs处理对菠菜细胞膜渗透率（A）和丙二醛含量（B）的影响Fig.3 Effect of ozone MNB treatment on cell membrane permeability (A)and MDA content (B) of spinach

果蔬采后伴随着后熟衰老过程，细胞膜降解是细胞组织衰老的信号，降解引发膜通透性增加，胞内离子外泄，所以常用细胞膜渗透率表示细胞在贮藏过程中完整性的变化[33]。图3A显示，贮藏2 d后，CK组细胞膜渗透率几乎呈线性增加，Ozone MNBs组细胞膜渗透率低于CK组，且6 d时两组差异显著（P＜0.05）。贮藏8 d时Ozone MNBs组渗透率仅为15.54%，表明此时细胞完整性较好。这是因为Ozone MNBs清洗果蔬时利用气泡破裂产生的冲击波对菠菜表面的杂质吸附洗涤，对叶菜造成的损伤较小[13]。果蔬受到损伤时诱导细胞膜中不饱和脂肪酸发生膜质过氧化反应，产生的脂质自由基促进细胞膜透性增加，丙二醛作为膜质过氧化的主要产物，其含量可用来反映过氧化作用的程度[34]。由图3B可知，丙二醛含量随贮藏时间的延长呈上升趋势，贮藏4～8 d时CK组丙二醛含量极显著高于Ozone MNBs组（P＜0.01），说明Ozone MNBs组菠菜细胞膜脂质过氧化程度低，细胞膜损伤程度小，这与细胞膜渗透率结果一致。表明Ozone MNBs是一种低机械伤处理方式。

2.4 Ozone MNBs处理对菠菜呼吸强度和乙烯释放量的影响

图4 Ozone MNBs处理对菠菜呼吸强度（A）和乙烯释放量（B）的影响Fig.4 Effect of ozone MNB treatment on respiratory intensity (A) and ethylene release (B) from spinach

采后果蔬在呼吸和乙烯的刺激下，自身逐渐走向衰老、死亡[35]。呼吸作用的强弱反映了物质消耗的快慢，这是因为果蔬采后失去了养分供应，生命活动主要以物质分解代谢为主，所以呼吸强度是影响果蔬耐贮性的重要因素[36]。图4A显示，贮藏过程中，两个处理组菠菜呼吸强度均呈上升趋势，CK组菠菜呼吸强度极显著高于Ozone MNBs组（P＜0.01），8 d时CK组呼吸强度达到643.34 mg/（kg·h），不利于菠菜的保鲜。乙烯是一种植物内源激素，Aked[35]认为它能够刺激和协调果蔬成熟过程中发生的生理变化，加速成熟衰老进程，所以在采后贮藏中常检测内源乙烯的释放量。由图4B可知，菠菜在贮藏4 d时达到最大乙烯释放量，CK组最大乙烯释放量为0.395 5 μL/（kg·h）。并且CK组菠菜乙烯释放量始终高于Ozone MNBs组，4～6 d时两组差异极显著（P＜0.01）。已有研究表明臭氧处理对甜瓜、柿子和梨等具有降低呼吸强度、抑制乙烯释放的作用[37-38]。说明Ozone MNBs处理可以有效抑制菠菜的呼吸作用和乙烯的释放，减缓自身消耗和衰老进程，延长菠菜的贮藏期。

2.5 Ozone MNBs处理对菠菜叶绿素含量和VC含量的影响

图5 Ozone MNBs处理对菠菜叶绿素（A）和VC（B）含量的影响Fig.5 Effect of ozone MNB treatment on chlorophyll (A) and vitamin C (B)contents of spinach

叶绿素是植物体内含量最高并且能参与光合作用的色素[39]，其降解引起的黄化现象使叶片新鲜度下降，其含量下降是植物衰老的外在标志[40]。图5A显示，贮藏过程中两个处理组的菠菜叶绿素含量均呈下降趋势。贮藏2～6 d时叶绿素含量保持平稳，Ozone MNBs组叶绿素含量极显著高于CK组（P＜0.01）。说明贮藏期间CK组菠菜在颜色和新鲜度方面不如Ozone MNBs组，这与感官评价结果一致。

新鲜的菠菜中含有丰富的VC，但它极不稳定，贮藏期间含量会迅速下降，这与菠菜的衰老和采后品质有关[41]，所以常用VC含量评价果蔬的营养品质和贮藏效果[22]。由图5B可看出，贮藏过程中菠菜VC含量处于快速损失的状态，贮藏4 d后，Ozone MNBs组VC含量极显著高于CK组（P＜0.01），8 d时CK组VC含量减少至0.011 0 mg/g。表明Ozone MNBs处理可有效缓解叶绿素和VC的损失，维持菠菜的外观品质和营养品质。

2.6 Ozone MNBs处理对菠菜过氧化氢含量的影响

植物在正常条件和遭受不良环境胁迫时会产生ROS，过量的ROS会导致植物品质劣变[42]。过氧化氢是ROS中活性最为稳定的一种[42]，它对植物的作用存在毒性阈值，低浓度时作为信号分子调节细胞对环境的适应性，高浓度时导致细胞氧化损伤甚至死亡[43]，而植物体内存在的抗氧化防御系统可以保护其免受伤害。图6显示，Ozone MNBs组和CK组过氧化氢含量分别在贮藏2 d和4 d时达到峰值，之后呈下降趋势，贮藏4 d后，CK组过氧化氢含量极显著高于Ozone MNBs组（P＜0.01）。表明Ozone MNBs处理可以减少过氧化氢的积累，减轻菠菜的氧化损伤。

图6 Ozone MNBs处理对菠菜过氧化氢含量的影响Fig.6 Effect of ozone MNB treatment on hydrogen peroxide content of spinach

2.7 Ozone MNBs处理对菠菜POD、CAT和APX活力的影响

图7 Ozone MNBs处理对菠菜POD（A）、CAT（B）、APX（C）活力的影响Fig.7 Effect of ozone MNB treatment on peroxidase (A), catalase (B)and ascorbate peroxidase (C) activity of spinach

POD、CAT和APX是植物体内重要的抗氧化酶，三者以不同的作用方式协同清除体内过氧化氢，降低对细胞组织造成的氧化伤害，提高植物的抗逆境胁迫能力[44]。由图7A～C可以看出，Ozone MNBs组菠菜POD、CAT和APX活力均高于CK组，并且POD活力最高。贮藏过程中，菠菜POD活力呈先降低后升高的趋势，6 d时两个处理组存在极显著差异（P＜0.01）；CAT活力整体呈下降趋势，2～4 d时CK组存在上升趋势；APX活力呈下降趋势，并且两组变化趋势相似，贮藏4 d后，Ozone MNBs组APX活力显著高于CK组（P＜0.05）。章宁瑛等[45]研究证实，4.28 mg/m3臭氧处理组蓝莓与对照组（未处理）相比能较好地保持POD、CAT和APX活力，使蓝莓果实呈现良好的抗逆性。表明Ozone MNBs处理可保持抗氧化酶的活力，降低过氧化氢积累对菠菜机体造成的氧化损害，减缓品质的劣变。

3 结 论

本实验探究了Ozone MNBs的低机械伤保鲜作用，以易受损伤的菠菜为实验材料，测定其在贮藏期间的生理指标。由细胞膜渗透率和丙二醛含量指标可知，Ozone MNBs处理可以有效降低细胞膜的损伤和丙二醛的积累，保持细胞的完整性，表明其具有低机械伤清洗作用。从其他指标可以看出，Ozone MNBs处理能延缓叶绿素和VC含量的下降，维持其感官品质和营养品质，通过抑制呼吸作用和乙烯的释放，减少养分的消耗，提高菠菜的耐贮性，并提高抗氧化酶的活性延缓过氧化氢积累对品质的劣变影响，从而具有保鲜作用。但从目前研究来看，缺乏微纳米气泡对叶绿素、酶等生理指标作用机理的研究。此外，微纳米气泡破裂会带来外源ROS，而过高的ROS积累对细胞产生病理效应，并且Ahmed等[5]发现氧气纳米气泡产生的ROS对作物的生长存在植物特异性，Ozone MNBs处理对果蔬保鲜是否也存在这种特异性，还需进一步的研究探索。