犬细小病毒免疫球蛋白的有效性评价∗

姜 旭 赵 健 倪婷婷 刘彦超 黄 宇 陈宪平 石 晶

(长春西诺生物科技有限公司,长春 130012)

犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)感染引起的一种急性传染病,临床表现上以剧烈呕吐、腹泻,严重至血腥腹泻为特征[1]。犬科、鼬科与猫科等物种感染后的死亡率不低于50%[2]。患病犬是本病的主要传染源,其排泄的粪便、唾液、呕吐物中含有大量CPV颗粒[3]。主要通过犬与犬的直接接触或由污染的饲料通过消化道感染,在各年龄段都有感染,在6周龄～6月龄之间更容易发病[4]。邓小芸等[5]对哈尔滨局部地区犬细小病毒病的流行状况进行研究,结果显示细小病毒感染不分品种,公犬和母犬均可发病,其中2月龄犬最易发。本病早期治愈率较高,中后期及混合感染都将极大降低治愈率。当前,CPV及其多种变异毒株在全球多个国家普遍流行,且宿主范围不断扩大[6]。

免疫球蛋白是抗感染免疫的主力,具有抗菌、抗病毒和抗外毒素等多种活性。特异性免疫球蛋白在宠物上并没有被广泛的应用。本公司研发团队开发了犬细小病毒免疫球蛋白注射液,为评价其有效性,使用本公司建立的犬细小病毒人工感染模型进行评价。

1 材料与方法

1.1 毒株及实验动物

攻击毒株:CPV-SD15株。

实验动物:比格犬,购自沈阳康平实验动物研究所,实验动物生产许可证号:SCXK(辽)2014-0003。实验前分别对候选的2～3月龄实验犬采集血液,分离血清,进行血凝抑制实验,筛选抗CPV抗体阴性(hemagglutination inhibition,HI≤1∶23)的犬只到本公司实验动物房进行实验。

1.2 CPV对实验犬的攻毒

实验前在动物房适应性饲养7 d,无异常情况,所有实验犬的粪便经CPV检测试纸测定为阴性。每日饲喂2次,保证饮水充足。饲养人员与实验员要严格更换消毒后的外衣、靴子和手套。将每只实验犬以咽部灌喂的方式进行攻毒,病毒液血凝效价为1∶27,剂量为 5 m L/次,共 3次,每次间隔 4 h。犬中有一只判定为发病即随机分组,根据治疗方法不同,分为模型对照组、对症治疗组与球蛋白治疗组,每组5只,开始评价实验。

1.3 评分与检测

观察实验犬的精神状态、饮欲/食欲、排便情况、呕吐情况,依据临床症状的轻重程度分为0～4分进行评分[7-8],评分标准见表1;采集肛门拭子,用CPV胶体金抗原检测试纸进行检测,若试纸检测为阳性,并具有犬细小病的临床症状,则判为发病。

表1 实验犬细小病毒病临床症状评分标准Table 1 Scoring criteria for clinical symptoms of the canine parvovirus disease

1.4 治疗

对症治疗组:每日依照症状进行止血、止吐、退热的对症治疗。主要包括:①氯化钠注射液30～80 m L、头孢噻呋钠 20 mg/kg;②5%葡萄糖注射液50～80 m L,注射用辅酶A100单位,ATP 20 mg、维生素C 200 mg 混合后,10 mL/kg;1次/d,连用7 d。

球蛋白治疗组:除同对症治疗组相同的辅助治疗外,加入犬细小免疫球蛋白注射液肌肉注射,1 m L/kg,1次/d。

1.5 统计方法

实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计,进行组间样本均数比较。

2 结果

2.1 排毒情况

实验期间内,每日采集肛拭子用CPV胶体金抗原检测试纸判断粪便排毒情况。经检测,攻毒后4 d,有2只实验犬开始排毒,对实验犬进行随机分组,攻毒后5 d有7只实验犬排毒,在攻毒后6 d全部排毒,其中,模型对照组与对症治疗组排毒持续3～5 d,球蛋白治疗组排毒3～4 d。

2.2 临床评分结果

实验期间,每日观察实验犬的临床症状,根据评分标准进行评分。三组实验犬在攻毒后均出现一定的临床症状,模型对照组临床评分逐日增加,2个实验组在治疗2 d后临床评分开始下降,模型对照组临床评分最高,球蛋白治疗组评分低于对症治疗组。与模型对照组相比,对症治疗组具有无明显治疗效果(P>0.05),球蛋白治疗组具有明显治疗效果(P<0.05),结果见表2。以病程为横坐标,以分数为纵坐标,绘制实验犬每日平均评分的折线图(图 1)。

表2 实验犬治疗前后评分统计结果Table 2 Statistical results of scores before and after the treatment of the canines

图1 实验犬每日平均评分结果Fig.1 Daily average score of the canines

2.3 血常规检测结果

实验期间,每日对实验犬进行全血血常规检测(表3),白细胞(WBC)的正常值为(6.0～17.0)×109/L。实验各组均出现不同程度的炎症反应,模型对照组WBC攻毒后4 d先上升后下降,对症治疗组与球蛋白治疗组的WBC在攻毒后4 d先上升后下降,但球蛋白治疗组的WBC在攻毒后8 d有平稳/回升的趋势。与模型对照组相比,对症治疗组与球蛋白治疗组无显著治疗效果(P>0.05),结果见表3。以病程为横坐标,以 WBC为纵坐标,绘制实验犬每日平均WBC的折线图(图2)。

表3 实验犬治疗前后WBC统计结果Table 3 Statistical results of WBC before and after the treatment of the canines

图2 实验犬每日平均W BC结果Fig.2 Daily average WBC results of the canines

2.4 生化检测结果

实验期间,每日对实验犬进行生化检测,其中,球蛋白(GLOB)的正常值为23～52 g/L。模型对照组与对症治疗组的GLOB在发病后逐日下降,球蛋白治疗组的GLOB开始发病时下降,随着每日注射,波动式回升。与模型对照组相比,对症治疗组具有显著治疗效果(P<0.05),球蛋白治疗组具有极显著的治疗效果(P<0.01),结果见表4。以病程为横坐标,以GLOB数目为纵坐标,绘制实验犬每日平均GLOB数目的折线图(图3)。

2.5 病理解剖结果

在本实验中,各组发病率均为100%;模型对照组的死亡率为80%,好转率为20%;对症治疗组的死亡率为60%,好转率为40%;球蛋白治疗组的死亡率为20%,好转率为80%。在实验犬死亡后,对其进行解剖,结果见图4,主要病变在小肠部位,模型对照组与对症治疗组空肠和回肠病变严重,可见明显的充血、瘀血以及肿胀,肠腔内有红色水样物,球蛋白治疗组基本正常。

图3 实验犬每日平均GLOB结果Fig.3 Daily average GLOB results of the canines

表4 实验犬治疗前后GLOB统计结果Table 4 Statistical results of GLOB before and after the treatment of the canines

图4 犬小肠解剖Fig.4 Anatomy of the canines′small intestine

3 讨论

球蛋白具有一定的免疫功能,能够阻断病原体对机体的危害,使病原体失去致病作用[9]。在医学上,特异性免疫球蛋白已经被广泛的使用,如乙型肝炎、狂犬病等[10],犬细小免疫球蛋白作为一种新型的犬细小病毒病治疗药有着很好的应用前景。如今,针对犬细小病毒病的治疗药物有干扰素、单克隆抗体等,但这些药物在犬中后期治疗中效果并不明显,且单克隆抗体的制备工艺复杂、成本高等限制了其应用。周灵等[11]进行了犬细小病毒免疫球蛋白对犬细小病毒中和活性的研究,结果表明犬细小免疫球蛋白的中和效果明显优于单克隆抗体,其免疫球蛋白的血凝抑制效价为1×211,中和效价为1∶873。在本实验中,治疗后的犬血凝抑制效价达到1×212,说明本实验中所使用的免疫球蛋白对犬细小病毒有很强的抑制作用。犬细小病毒免疫球蛋白可提高犬血液中抗体水平,中和病犬体内的细小病毒,有效阻止细小病毒对机体的继续感染和侵害,发挥治疗犬细小病毒病的作用。同时,犬细小免疫球蛋白自身又具有机体免疫调L作用,能激活病犬体内的免疫细胞吞噬侵入的病原,迅速增强病犬免疫力和抵抗力[12-13]。在犬细小免疫球蛋白的临床实验方面,李六金等[14]进行了抗犬细小病毒免疫球蛋白的临床应用研究,结果发现应用犬细小免疫球蛋白进行治疗可以大大地提高犬细小病毒病的治愈率。在本实验中,实验组与对照组及对症治疗组在治疗效果上的对比也很好地反映了犬细小免疫球蛋白在犬细小病毒病治疗方面的优势作用。

以人工感染的模型对照组为基础评价犬细小免疫球蛋白的治疗效果。根据实验犬表现出临床症状的差异进行评分,症状越严重,分值越高,模型对照组评分逐日增加,发病后,模型对照组评分最高,对症治疗组评分次之,球蛋白治疗组明显低于另外2组。犬在感染细小病毒时会伴随白细胞数目的变化,通常会引起白细胞数目的下降,通过对患病犬进行血常规检查,可以通过观察白细胞的数目推测该犬的病程及治愈状况[15],模型对照组WBC数目先降低然后升高最后大幅下降,对症治疗组与球蛋白治疗组比模型对照组的WBC更稳定,而球蛋白治疗组比模型组更稳定。球蛋白具有免疫作用,当外来的刺激物入侵机体时,免疫系统会调控球蛋白的增殖对其进行抵抗[16]。根据生化检测结果,可以针对临床症状调整用药,有利于提高CPV的治疗率。血凝抑制效价与中和抗体效价具有一定正相关关系[17],模型对照组在攻毒后产生的HI抗体逐渐升高,而球蛋白治疗组在注射免疫球蛋白后HI效价较模型对照组以及对症治疗组更高且稳定。通过解剖结果,模型对照组与对症治疗组实验犬的小肠部位可见明显的肠炎型犬细小病毒病的症状,球蛋白治疗组实验犬在治疗后小肠未见明显病变。综上所述,犬细小免疫球白具有较好的治疗效果,可大大提高治愈率,发挥治疗的作用。

本实验表明,通过犬细小病毒人工感染模型组与治疗组的临床评分、WBC、GLOB以及病L解剖结果进行分析,可以对比出犬细小免疫球蛋白能够提高犬细小病毒病的好转率,为评价该治疗性药物的有效性研究奠定基础。