2 084例急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物中百日咳鲍特菌核酸检测分析

陈楠，潘蕊，方玉莲，王维，侯梦珠，林书祥

1天津市儿童医院，天津300134；2天津市儿科研究所

百日咳是(Pertussis)由百日咳鲍特菌(B. pertussis)引起的具有高度传染性的呼吸道疾病，在六个月以下的儿童中具有高度传染性，其中三个月以下的婴儿的百日咳住院率、出现并发症和死亡的概率都是最高的。百日咳鲍特菌在疫苗接种出现之前，该疾病被普遍认为是一种儿科疾病，因为婴儿和儿童的死亡率及发病率极高，但其实在孕妇和老年人人群中，出现可能危及生命的呼吸系统疾病的情况也非常严重，也需引起高度重视。尽管针对这种病原体的疫苗接种覆盖率很高，但百日咳仍然是全球持续存在的公共卫生问题，也是全世界疫苗可控性最差的疾病之一。近年，即使是在接种了全细胞或无细胞疫苗的国家，百日咳也已重新出现，且发病率逐年升高[1～3]。且百日咳的流行模式已从过去的儿童-儿童模式转变为现在的青少年(成人)-儿童模式[4,5]，婴幼儿的感染主要发生在家庭中(75%～80%)，父母和兄弟姐妹是最常见的感染源。目前核酸扩增法如PCR是诊断百日咳非常敏感的方法，百日咳鲍特菌培养是常规的金标准方法，但实时PCR诊断百日咳所需时间更短，且灵敏度更高,需要鼻咽抽吸或拭子[6]。目前临床尚未见百日咳鲍特菌IS481靶位进行百日咳鲍特菌的核酸检测报道。为此，我们设计了百日咳鲍特菌IS481靶位的特异性引物，检测急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物百日咳鲍特菌的感染情况。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2017年7月～2019年6月间天津市儿童医院收治入院的急性呼吸道感染患儿2 084例。2 084例患儿中男1 298例(62.3%)、女786例(37.7%)，男女比例为1.65∶1；年龄为57时～72月(10.21±10.19)月。其中≤1个月307例(14.7%)，1～6个月605例(29.0%)，6～12个月795例(38.1%)，12～24个月246例(11.8%)，24～36个月101例(4.8%)、36～48个月22例(1.1%)，48～60个月4例(0.2%)，>60个月4例(0.2%)；均有明显呼吸道感染症状。本研究经本院伦理委员会批准同意，纳入者家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 百日咳鲍特菌核酸检测方法 在2 084例住院患儿的鼻炎分泌物标本中吸取100 μL，按细菌总DNA提取试剂盒 (AXYGEN，美国)操作说明书进行DNA提取，操作过程严格按照说明书进行。提取出的细菌总DNA在-20 ℃保存备用。

运用PCR方法对百日咳杆菌插入序列IS481基因片段(长145 bp)进行扩增，根据文献[7]合成引物序列Pertussis-IS481-P1 GATTCAATAGGTTGTAT-

GCATGGTT, Pertussis-IS481-P2 TGGACCATTTCGA-GTCGACG。每次PCR反应均设立阴性、阳性对照。

所有PCR扩增反应均在25 μL总反应体系中进行，5 μL模板，其他试剂参照试剂盒配制，用ddH2O补足。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，30个循环，72 ℃延伸5 min。凝胶电泳检测扩增产物：用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行分析，选取琼脂糖凝胶电泳鉴定结果阳性的PCR产物，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.3 统计学方法 应用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理。计数资料以例(%)表示，采用χ2检验进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2 084份鼻咽抽吸物标本中百日咳鲍特菌阳性率为2.21%(46/2 084)。46份阳性样本的PCR扩增产物经测序，将测序结果与Genbank数据库中的序列进行比对分析，证明为百日咳鲍特菌。

46例百日咳鲍特菌阳性的患儿中男22例、女24例，二者性别比较差异具有统计学意义(χ2=4.186，P<0.05)。2 084份患儿鼻咽抽吸物标本中百日咳鲍特菌阳性检出率分别为≤1个月2.0%(6/307)、1～6个月2.0%(12/605)、6～12个月2.3%(18/795)、12～24个月1.22%(3/246)、24～36个月1.98%(2/101)、36～48个月9.1%(2/22)、48～60个月50%(2/4)，>60个月25%(1/4)，各年龄段患儿中鼻咽抽吸物标本中百日咳鲍特菌阳性检出率差异有统计学意义(χ2=58.163，P<0.05)。

2 084例患儿中，春、夏、秋、冬季各530、502、506、546例，鼻咽抽吸物标本中百日咳鲍特菌阳性率分别为1.9%(10/530)、2.0%(10/502)、4.2%(21/506)、0.9%(5/546)。不同季节呼吸道百日咳鲍特菌阳性检出率间差异有统计学意义(χ2=13.428,P<0.05)。

3 讨论

百日咳主要是由百日咳鲍特菌引起的一种传染性极强的急性呼吸系统疾病，与5岁以下儿童咳嗽发作时间延长和死亡有关,以易感者吸入带菌飞沫而被感染。与其他传染病相比，百日咳是一种相对较新的感染性疾病[6]。

百日咳鲍特菌是一种可以引起百日咳或百日咳的呼吸道疾病的革兰氏阴性短小杆菌，无鞭毛芽孢，专性需氧，最佳生长温度为35 ℃～37 ℃。百日咳鲍特菌最初是由Bordet和Gengou在1900年观察到并在1906年成功分离的[8]。腺苷酸环化酶毒素(CyaA)是百日咳鲍特菌产生的主要毒力因子之一。CyaA在百日咳鲍特菌的呼吸道定植的早期阶段起重要作用[9,10]。该毒素使用原始的中毒机制：一旦被有毒细菌分泌，它便能够通过独特但鲜为人知的机制侵入真核靶细胞，导致细胞死亡。细胞中毒过程涉及直接跨靶细胞质膜的CyaA催化结构域易位的独特机制。据统计所有年龄组都易受百日咳感染，其感染对成人可能症状较轻微，但对婴儿有可能危及生命。且在未接种疫苗的婴儿中，该疾病更为严重，其中可能发生惊厥，支气管肺炎和脑病等致命性并发症。本次研究中，共收集急性呼吸道感染患儿鼻咽抽吸物标本2 084份，使用百日咳鲍特菌IS481靶位的特异性引物进行检测。其中百日咳鲍特菌阳性患儿46例，阳性患儿中男女比例约为1∶1。在各年龄组中，以6～12个月组阳性检出例数最多，共18例，占全部阳性患儿的39.1%(18/46)；其次是1～6个月共12例，占全部阳性患儿的26.1%(12/46)；≤1个月6例，占全部阳性患儿的13.0% (6/46)。在一年的研究时段中，春、夏、秋、冬季标本中百日咳鲍特菌阳性检出率分别为1.9%(10/530)、2.0%(10/502)、4.2%(21/506)、0.9%(5/546)。本次研究中，患儿鼻咽抽吸物标本百日咳鲍特菌阳性检出率在不同性别、年龄段、发病季节间的差异有统计学意义。

近年来，引起百日咳的百日咳鲍特菌在全球范围内重新成为一种重要的病原体。医护人员以及公众对这种疾病缺乏认识和临床表达的差异性是文献报道[6]的可能导致百日咳再次流行的原因。医护人员和公众仍然认为百日咳是仅会影响幼儿的疾病因而会导致它在成人患者中的诊断不足，因为在老年患者中不考虑这种诊断。同时，由于该疾病的临床表达在很大程度上取决于相关人群的免疫水平，所以婴儿、儿童、青少年和成年人之间百日咳的临床症状也有所不同，这也可能影响对该疾病的诊断和治疗。因此，对百日咳的持续关注和研究工作也显得尤为重要。另外，百日咳主要通过免疫接种控制，但尽管疫苗接种计划导致儿童死亡率持续下降，百日咳仍在继续流行[11]。效力明显下降的原因包括随着时间的推移，免疫力下降，以及可能从突变的百日咳鲍特菌中“疫苗逃逸”，这可能会使其避免疫苗相关的免疫反应[12]。然而，疫苗接种仍然是最好的控制方法，因为抗生素治疗仅在疾病早期有效[13]。监测目前流行的菌株对公众的健康控制至关重要，既可以追踪社区中百日咳鲍特菌的传播，也可以为未来的疫苗开发提供急需的信息。

综上所述，天津地区急性呼吸道感染患儿百日咳鲍特菌感染阳性率较高。