利用高通量测序技术分析阳虚体质人与平和体质人外泌体miRNA表达谱异同

王乐鹏 王婷 霍瑰阳 蔡亚楠 刘文斌 黄光瑞 袁凯

阳虚体质是中医人体九种体质的一种类型。阳虚体质人群常常表现出怕冷、容易疲劳、肌肉松软等阳虚相应的特征[1]。外泌体是近年来兴起的重要研究领域[2]。2013年的诺贝尔奖表彰了发现外泌体调控运输机制的三位科学家。外泌体是一种由于细胞内溶酶体微粒内陷而造成的囊泡[3]。该囊泡中包含了非常复杂的蛋白质与RNA。外泌体中的RNA包括mRNA、miRNA、lncRNA以及其他各种非编码RNA[4]。外泌体参与多种生物学功能，包括作为介质工具传递相关信号，从而实现细胞与细胞之间信息的交流[5]。目前在多种疾病的研究中，均发现外泌体在疾病的发病过程中发挥着重要作用。如肿瘤的微环境中，外泌体参与肿瘤的生长、分化、凋亡和转移[6]。除了参与肿瘤发病，既往研究还发现外泌体参与的信号调节非常广泛地参与神经系统疾病、心血管疾病、内分泌疾病的病理生理过程[7]。

本研究将中医阳虚体质与外泌体结合起来研究，利用高通量测序技术，分析阳虚体质人群外泌体miRNA表达谱。通过对miRNA表达谱的研究，希冀得到外泌体在阳虚体质人群中的相应作用。为相应体质人群防病治病得到理论支撑。

1 材料与方法

1.1 血液样本来源

本研究从北京中医药大学在校学生中招募志愿者，共招募阳虚体质3名，平和体质3名。健康人平和体质与阳虚体质根据中华中医药学会2009年实施的《中医体质分类与判定》来判定，并且接受中医专家诊断。所有参与者在进入研究之前均已签署书面知情同意。参与者无慢性疾病，无心、肝、肾、消化道、呼吸、血液、神经系统等疾病；体格检查未发现临床意义的阳性体征；实验室检查未发现异常。根据纳入标准和排除标准，本研究共纳入受试者6名，包括3名阳虚体人，3名平和体质人。阳虚体质的症状特点包括手脚凉、胃脘部背部怕冷、穿衣多、不耐受寒冷、易感冒、冷饮后不适、冷饮后腹泻等。平和体质包括精力充沛、说话有力、睡眠良好、适应外界环境变化等。6名受试者均为北京中医药大学在校学生，能够减少教育程度与年龄等混杂因素影响，从而能够更好比较阳虚体质与平和体质的差异。本研究抽取每位参与者20 mL外周血。研究对象为循环外泌体RNA。通过高通量测序对外泌体RNA进行了分析。研究方案获得北京中医药大学伦理委员会批准(KTPJ-BZYSY-2017-01)。

1.2 外泌体提取和定量分析

在本研究中，使用exoEasy Maxi试剂盒(QIAGEN，USA)，根据制造商的说明从血浆样品中分离外泌体。此外，外泌体miRNA通过miRNeasy试剂盒(QIAGEN，USA)制备[8]。提取的RNA质量与数量由Agilgent Bioanalyzer 2100鉴定。细胞RNA由RNA 6000 Pico试剂盒检测分析。

1.3 外泌体RNA测序分析

使用miRNeasy试剂盒用来分离外泌体中所有小RNA。利用Illumina HiSeq 2000平台对RNA进行测序分析[9]。

1.3.1 RNA测序数据处理 利用HISAT2将读取的数据映射到参考数据库CRCh38。使用miRDeep2软件和RNAfold分析miRNA。miRNA表达量计算采用TPM(transcript per million)计算度量指标，TPM含义是以每百万比配成对序列做miRNA表达量指标，其中总比配成对 read 数目用于归一化表达量数值。以“P<0.05，倍数变化>2”为阈值显着性，确定miRNA差异表达。

1.3.2 miRNA差异火山图绘制 对不同分组间(样本间)筛选出来的差异miRNA进行统计。从而比较阳虚体质人与平和体质人之间血清外泌体miRNA的异同。将比较所产生的差异情况反映到火山图中，灰色为非差异miRNA，红色为上调显著差异miRNA，绿色为下调显著差异miRNA。

1.3.3 表达模式聚类分析 对差异表达miRNA进行层次聚类。计算多个样品两两之间的距离，构成距离矩阵，合并距离最近的两类为一新类，用挑选的差异miRNA的表达情况来计算样品直接的相关性，用热图展示。

1.4 差异基因功能富集分析

1.4.1 差异miRNA的靶基因预测 得到差异miRNA之后，使用miRanda算法预测差异miRNA的靶向基因。 选择差异表达的miRNA的MiRanda目标进行功能注释。

1.4.2 GO分析 GO功能分析是针对全基因/转录本和差异miRNA靶基因/转录本进行功能注释和归类。将全基因/转录本作为背景列表，差异miRNA靶基因/转录本列表作为从背景列表中筛选出来的候选列表，使用 Fisher 算法分别对各比较组差异miRNA预测的靶基因基因从分子功能(Molecular Function)、细胞成分(Cellular Component)和参与的生物过程(Biological Process)三个方面进行富集分析。

1.4.3 KEGG分析 KEGG功能注释通路显著性富集，确定差异基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。利用KEGG数据库对差异miRNA靶基因进行Pathway分析，并用超几何分布检验的方法计算每个Pathway条目中差异miRNA靶基因富集的显著性。

1.5 统计分析

本研究使用SPSS统计软件进行数据处理。miRNA表达量计算采用TPM(transcriptpermillion)计算度量指标，TPM公式=(每条miRNA比对到的read数目)/(样本总比对read数目)×106。基因表达与临床参数的相关性使用Pearson相关系数进行。P<0.05时，表示其差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 阳虚体质与平和体质血清外泌体miRNA差异表达谱

本研究中，根据具有TPM倍数变化>2且表达中P<0.05的差异用来过滤miRNA。得到阳虚体质与平和体质对比火山图(见图1)。经过滤分析后，共筛选出28种miRNA。阳虚体质人与平和体质人相比上调的miRNA共有19种，包括hsa-miR-101-3p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-24-1-5p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-3157-5p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-374a-5p等。阳虚体质人与平和体质人相比下调的miRNA共有9种，包括hsa-miR-409-3p、hsa-miR-625-3p等。此外，利用层次聚类分析(Hierarchical Clustering analysis)得到阳虚体质与平和体质miRNA的可视化差异(见图2)。结果表明，阳虚体质人中有19种miRNA表达高于平和体质人，9种miRNA表达低于平和体质人。

注：阳虚体质上调miRNA为红色表示。阳虚体质下调miRNA为绿色表示。

2.2 血清外泌体miRNA靶基因的GO分析

得到3例阳虚体质人与3例平和体质人的差异血清外泌体miRNA后，对阳虚质与平和质的差异miRNA进行靶基因预测。利用GO方法，对预测为差异表达外泌体miRNA靶标的基因进行分析，以期得到组间差异基因的生物过程(Biological Process)、细胞成分(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function)三个方面功能。如图3显示，相关的生物学过程包括DNA模板转录、信号转导、RNA聚合酶II转录调节、蛋白磷酸化、细胞内信号转导等。细胞组分包括细胞核、细胞质、胞质溶胶、质膜、核质等。分子功能包括蛋白结合、金属离子结合、ATP结合、DNA结合、RNA聚合酶II活性等。

图2 阳虚体质与平和体质血清外泌体miRNA差异表达谱热图

注：绿色代表生物学过程(GOBP)，蓝色代表细胞成分(GOCC)，红色代表分析功能(GOMF)。

2.3 差异血清外泌体miRNA靶基因的KEGG途径富集

得到3例阳虚体质人与3例平和体质人的差异血清外泌体miRNA后，对阳虚质与平和质的差异miRNA进行靶基因预测。为了确定针对整个参考基因背景的特定miRNA靶标，使用了预测为差异表达的外泌体miRNA靶标的基因进行了KEGG富集分析。差异表达的miRNA的靶标主要相关包括器官系统、代谢、疾病等。在器官系统中，相关系统包括免疫系统，内分泌系统、神经系统等。代谢中，包括脂质代谢、核苷酸代谢、氨基酸代谢等。相关疾病中，包括肿瘤、感染性疾病、内分泌代谢性疾病、神经退行性病变等。基因相关包括转录、翻译等。具体内容详见图4。

3 讨论

中医体质学是中医学具有非常鲜明特色的学科。体质现象是人体结合先天和后天所形成的具有独特生理与心理特点的特质。本研究利用外泌体作为切入点，以期得到阳虚体质人群的生物学基础，以及阳虚体质人群与平和质人群的差异，从而更好地为体质调理及防病治病提供理论依据。

在本研究中，通过比较阳虚体质人与平和体质人的miRNA差异，发现阳虚体质人上调的miRNA包括hsa-miR-101-3p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-24-1-5p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-3157-5p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-374a-5p等。阳虚体质人下调的miRNA包括hsa-miR-409-3p、hsa-miR-625-3p等。在差异miRNA中，许多种类的miRNA如hsa-miR-101-3p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-19b-3p等均与肿瘤、免疫性疾病、内分泌疾病的发生发展密切相关。外泌体miRNA参与多种人体生理病理功能调节，在免疫及内分泌系统，参与激素与抗体的生成与调节，从而在肿瘤和免疫性疾病的发生发展过程中起到重要作用。

通过对预测为差异表达的外泌体miRNA靶标的基因进行功能富集分析，发现阳虚体质与平和体质人群相比，易患疾病包括肿瘤与感染性等疾病。中医认为肿瘤的发生多为体质虚寒，阳虚于内而气化不足，导致内邪如痰饮、瘀血等积聚成块而致病[10]。缺乏阳气运化，湿浊痰饮等邪气停留体内，不能气化，又与寒邪瘀血等交织在一起，则容易形成各种良性或恶性肿瘤。故中医对肿瘤的治疗方法就包括宣通阳气，将阴浊瘀血水饮痰湿等邪气驱散，从而达到治疗疾病的目的[11]。在感染性疾病中，由于缺乏阳气顾护，则人体更加容易受到感染性疾病的侵袭。正气存内则邪不可干，一旦人体出现阳气虚衰、 正气不足的表现时， 常常会罹患伤寒

注：粉红色代表器官系统，蓝色代表代谢相关，浅蓝色代表人类疾病，绿色代表基因信息传递，褐色代表环境因素传递，粉色代表细胞过程。

等传染性疾病。该研究结果认为阳虚体质人更容易罹患肿瘤和感染性疾病，可以解释其阳虚体质寒邪致病的机理。

此外，阳虚体质与平和体质的差异系统主要在内分泌系统与免疫系统。上海中医药大学沈自尹院士研究证明，肾阳虚证者存在下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能低下和紊乱，并用现代科学方法证实其有特定病理基础[12]。该研究从外泌体miRNA作为切入点，发现内分泌系统与免疫系统是阳虚体质与平和体质的差异系统。内分泌系统中的下丘脑-垂体-肾上腺轴与下丘脑-垂体-甲状腺轴恰恰反映了中医阳气的概念，肾上腺分泌的肾上腺素与去甲肾上腺素，甲状腺分泌的甲状腺，是人体重要的内分泌激素[13]。当肾上腺激素或者甲状腺激素分泌不足时，人体会出现疲倦、嗜睡、精神不振、记忆力减退、四肢冰冷、怕冷、畏寒等典型的阳虚体质表现[14]。对于免疫系统，中医学也认为其与阳气密切相关。中医学认为有阳气顾护人体，阴寒邪气难以侵袭入里，伤害人体。而当阳气不足时，风寒湿三邪非常容易侵袭体表，从而导致疾病发生。

此外，阳虚体质人与平和体质人的差异基因功能还体现在信号转导、信号分子与相互作用。在免疫系统与内分泌系统中，有大量的细胞因子参与信号转到，外泌体miRNA也参与细胞因子的信号转导[15]。故而能够体现阳虚体质与平和体质的差异。

综上，本研究通过研究阳虚体质与平和体质的外泌体miRNA，分析阳虚体质与平和体质的差异，发现阳虚体质与平和体质相比的易患疾病，从而为体质养生与体质调摄提供理论与实践依据。