加味温胆汤对慢性不可预见性温和应激大鼠的抗抑郁作用及色氨酸—犬脲氨酸代谢通路的影响

陈颖 张丽萍 宋瑞雯 徐磊

抑郁症是一种情感障碍性精神疾病，以显著而持久的心境低落为主要特征，常伴有情绪抑郁、焦虑、兴趣减退、躯体不适、食欲不振等症状。临床中常见的抗抑郁西药如氟西汀、帕罗西汀等，长期服用易产生恶心、失眠等副作用，影响患者的依从性。而中医药辨证论治、身心整体调理的特点，中药复方多成分、多靶点、多层次的药理作用，在治疗抑郁症上具有一定的优势。抑郁症严重危害人类心身健康，其发病机制尚未阐明，存在多种假说：细胞因子假说、HPA轴假说、单胺类神经递质假说、神经可塑性假说等，其中细胞因子假说中的色氨酸—犬脲氨酸(tryptophan- kynurenine,TRP-KYN)的代谢通路被证实和抑郁症密切相关[1]。TRP-KYN通路的多种代谢产能够影响神经可塑性。近年来，较多研究发现吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine2,3 -dioxygenase,IDO)，一种色氨酸降解酶，是TRP-KYN代谢通路上的第一个限速酶，且其水平和抑郁样症状呈正相关[2]；IDO增多或过度激活导致TRP更多的代谢为KYN，大量耗竭TRP。KYN的下游代谢产物中：3-羟基犬脲氨酸(3- hydroxy kynurenine,3-HKYN)、3-羟邻氨苯甲酸(3- hydroxy anthranilic acid,3-HAA)、喹啉酸(quinolinic acid,QUIN)具有神经毒性作用，犬脲喹啉酸(kynurenic acid,KYNA)能对抗QUIN的毒性而具有神经保护作用[3]。本研究以调理中焦脾胃气机立法，观察中药复方加味温胆汤的抗抑郁作用，并研究其对TRP-KYN代谢通路的影响，阐明加味温胆汤的抗抑郁效应及对TRP-KYN通路的影响，探讨代谢产物的神经保护/毒性作用在抑郁症发病中的机制。

1 材料与方法

1.1 药物及制备

加味温胆汤(由竹茹6 g、半夏10 g、厚朴10 g、石菖蒲20 g、云苓30 g、陈皮10 g、枳实10 g、合欢花30 g、桃仁10 g、郁金15 g、姜黄30 g、柏子仁30 g、远志6 g、大黄3 g、炒麦芽30 g、生薏苡仁30 g等组成)，上述药材均由北京同仁堂药业有限公司提供，水煎浓缩为1.5 g/mL，放置4℃冰箱内备用。盐酸氟西汀规格为20 mg/粒(批号：H20170003)，Patheam France(礼来苏州制药有限公司)分装 。

1.2 主要试剂和仪器设备

TRP试剂盒(货号：SBJ-M0728-96T)、KYN试剂盒(货号：SBJ-R0979-96T)、3-HKYN试剂盒(货号：SBJ-R0982-96T)、3-HAA试剂盒(货号：SBJ-R098-96T)、QUIN试剂盒(货号：SBJ- R0984-96T)、KYNA试剂盒(货号：SBJ-M0328-96T)，均购自南京森贝伽生物科技有限公司。大鼠束缚架(自制)，旷场实验箱(自制)：长×宽×高=100 cm×100 cm ×40 cm，摄像机(Panasonic，Japan)，ACS-2EAS型电子秤(北京市菲姆斯科技有限公司)，Etho Vision3.0分析软件(Noldus)，低温高速离心机(Eppendorf)，37℃恒温箱(BINDER)，Sunrise Romote 酶标仪(天津天美国际贸易有限公司提供)。

1.3 实验动物及分组

清洁级雄性SD(Sprague Dawley)大鼠48只，体质量(200±20)g。由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供，合格证号：SCXK-(京)2017-0001。饲养于中国医学科学院放射医学研究中心，动物的饲养和使用符合国际动物伦理法，适应性饲养1周后进行动物实验。饲养室温度为(22±2)℃，光照时间为8:00～20:00。 将48只大鼠按照体质量随机分为4组，每组12只，分别为空白组、模型组、西药组、中药组。空白组不给予任何刺激。其余3组孤养，并给予多种不同刺激，制备慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)抑郁大鼠模型[4]。

1.4 模型制备

模型制备方法[4]具体如下：除空白组外，其余各组采用慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)结合孤养方法进行模型制备。空白组群养，自由进水食，不接受任何刺激。其余3组单笼饲养，给予21天不同刺激，包括24小时禁水、24小时禁食、4℃冷水游泳5分钟、45℃热刺激5分钟、夹尾1分钟(用塑料夹子夹住距大鼠尾尖1 cm处)、鼠笼倾斜45° 24小时、潮湿垫料24小时、噪音15分钟、明暗颠倒24小时共9种刺激，每天随机安排不同的刺激，使大鼠不能预料刺激的发生，同一种刺激不能连续出现，且在21天内不超过3次。

造模成功后，给予药物连续灌胃4周，西药组灌胃氟西汀1.8 mg/(kg·d)，中药组灌胃加味温胆汤12 g/(kg·d)，空白组自由饮水，模型组每日灌胃等量生理盐水。

1.5 指标检测

1.5.1 外观表征和体重 观察大鼠皮肤毛发的色泽、枯荣；活跃状况；爬行状态、饮食情况；大小便状态等。在造模前后及给药干预后测量大鼠的体质量变化。

1.5.2 行为学检测 (1)旷场实验：旷场实验箱由不透明的黑色硬纸板制造，底面为100 cm ×100 cm的正方形，被平均分为25个10cm ×10 cm的等边小方格，周围是高40 cm的黑色硬纸板。模型建立前后及给药干预结束后1天的14:00～18:00在安静的环境下进行旷场实验。将大鼠放入旷场地面中央，同时摄像机进行摄像和计时，计时4分钟，每只大鼠进行1次实验，完毕后彻底清洁实验箱再进行下一只大鼠的实验。观察大鼠在后3分钟内穿越格数，大鼠4爪均进入方格，记数为水平运动得分1分，两后肢直立次数，两前肢腾空或攀附侧壁，记数为垂直运动得分1分，两者分数之和记为总得分。(2)糖水偏好实验：各组大鼠在造模前后及给药干预后给予糖水消耗实验。实验前先进行糖水适应，给予两瓶1%的蔗糖水24小时后，再给予一瓶1%的蔗糖水、一瓶纯水24小时，12小时时交换两瓶的位置，禁食禁水24小时，予一瓶1%的蔗糖水、一瓶纯水，两瓶位置随机放置，观察其在1小时内的糖水和纯水的消耗量，并排除饮水瓶滴漏所致的液体消耗量。糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×100%。(3)分子生物学检测：在大鼠药物干预结束后，断头取血1.5 mL静置30分钟，3000 r/min离心10分钟，取上清液于干净的EP管中，置于-80℃冰箱保存待测。用ELISA法测定大鼠血清TRP-KYN代谢通路相关分子TRP、KYN、3-HKYN、3-HAA、QUIN、KYNA的含量。主要试剂：TRP、KYN、3-HKYN、3-HAA、QUIN、KYNA ELISA试剂盒由南京森贝伽生物科技有限公司提供，测定按照试剂盒说明严格进行。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠外观表征和体重变化

药物干预后，观察各组大鼠的外观表征，模型组大鼠皮毛粗糙，色泽暗淡，爬行活跃程度明显低于空白组，大便稀溏、小便频数色黄。中药组和西药组皮毛色泽明亮、细腻光滑；活动度明显高于模型组、饮食情况良好；大便、小便情况尚可。

造模前各组大鼠体质量无统计学意义。21天慢性应激后，与空白组比较，模型组、中药组、西药组大鼠体质量显著降低(P<0.05)；药物干预后，与空白组比较，模型组大鼠体质量降低(P<0.05)，与模型组比较，中药组和西药组体质量显著增加(P<0.05)，中药组和西药组大鼠体质量无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量变化比较

2.2 各组大鼠行为评价结果比较

造模前各组大鼠的活动度和糖水偏爱差异均无统计学意义。21天慢性应激后，与空白组比较，其余三组糖水偏爱率显著降低(P<0.05)，药物干预4周后，与模型组比较，中药组和西药组显著增加抑郁大鼠糖水偏爱度(P<0.05)，中药组和西药组无明显差异(P>0.05)。药物干预4周后，与模型组比较，中、西药组大鼠的自主、探索活动明显增加，旷场实验得分显著升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠糖水偏好与旷场实验结果比较

2.3 各组大鼠TRP-KYN代谢通路分子含量变化比较

与空白组相比，模型组TRP、KYNA显著降低(P<0.05)，与模型组相比，中药组、西药组明显升高(P<0.05)；与空白组比较，模型组KYN显著升高(P<0.05)，与模型组比较，中药组、西药组明显降低(P<0.05)，中、西药组无统计学差异，见表3。

表3 各组大鼠血清TRP、KYN、KYNA的含量比较

与空白组相比，模型组3-HKYN、QUIN、3-HAA显著升高(P<0.05)，与模型组相比，中药组、西药组3-HKYN、QUIN、3-HAA显著降低(P<0.05)，中、西药组无统计学差异，见表4。

表4 各组大鼠血清3-HKYN、3-HAA、 QUIN的含量比较

与模型组比较，中药组和西药组KYN/TRP比值降低，差异有统计学意义(P<0.05)。中药组和西药组较之模型组，KYN/QUIN比值增大(P<0.05)，KYN/KYNA比值减小(P<0.05)，中药组和西药组差异无统计学意义，见表5。

表5 各组大鼠TRP-KYN代谢通路KYN/TRP、 KYN/QUIN、KYN/KYNA比较

3 讨论

中药复方多环节、多靶点抗抑郁，具有独特的优势。中医学通过辨证论治，认为抑郁症主要有肝郁气滞、痰气郁结、气郁化火、心脾两虚、肝肾不足等证型。临床上相应的治法为舒肝理气、化痰解郁、补益心脾、滋养肝肾[5]。近年来研究表明，抑郁症亦存在脏腑气机失调，通过调理中焦脾胃，使气机升降出入通畅，则诸郁得舒。本实验以此遣方，选用南北朝《集验方》温胆汤化裁成加味温胆汤，由半夏、竹茹、枳实、陈皮、茯苓、合欢花、石菖蒲等组成，全方理气化痰和胃，健脾祛湿，调中行气，驱化痰浊，则郁证自解[6]。本实验以此为理论基础，研究加味温胆汤的抗抑郁作用及对TRP-KYN代谢通路的影响。

现代研究表明TRP-KYN代谢途径和抑郁症之间有密切的联系[7]。TRP 是人体内的必需氨基酸，其分解途径有5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)途径和KYN途径，约 95%的 TRP 在降解酶IDO或色氨酸 2，3-双加氧酶(TDO)的作用下生成 KYN。Schäfer A等[8]研究发现当机体在应激的情况下，体内TRP减少而KYN生成增加。当炎症诱导IDO激活时，KYN更多的代谢为KYNA，大量耗竭TRP，使得可代谢生成5-HT的色氨酸减少，导致5-HT的生成不足[9]，进而影响杏仁核功能，导致大脑皮层过度兴奋，出现情绪焦虑、烦躁、失眠等抑郁样症状。

KYN可在不同催化酶作用下形成TRP-KYN-3-HKYN和TRP-KYN-KYNA两条代谢途径。TRP-KYN-3-HKYN代谢途径：是KYN在犬尿氨酸羟化酶的作用下生成3-HKYN，继而由犬尿氨酸酶(KYNU)催化水解生成3-HAA，最后经过多级酶促反应生成QUIN、吡啶羧酸类及尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)等活性分子参与体内各种生理过程。TRP-KYN-KYNA代谢途径：是KYN在犬尿氨酸氨基转移酶(KAT )的作用下，生成KYNA。QUIN是NMDA受体的内源性激动剂，机体QUIN增多会产生兴奋性神经毒性作用，其水平升高可损伤神经元的轴突，引起神经的退行性病变，而TRP-KYN通路上的KYNA是NMDA受体的内源性拮抗剂，能够对抗喹啉酸的神经毒性作用，具有神经保护作用[10]。当生理状态时，两代谢产物相对平衡；但当机体处于应激或者抑郁状态时，KYN代谢倾向于TRP-KYN-3-HKYN途径，神经毒性作用增强，可致神经退化甚至凋亡。本研究中CUMS抑郁大鼠TRP含量降低，KYN升高，具有神经保护作用的KYNA含量降低、神经毒性代谢产物3-HKYN、3-HAA、QUIN含量增高，加味温胆汤组结果与模型组相反，但和西药氟西汀组药效相似。

IDO作为TRP-KYN代谢通路的限速酶，能降低色胺氨酸、升高犬尿氨酸含量，KYN和TRP的比值可作为判断IDO活性的指标[11]，比值越大，IDO活性越大，反之活性越小。本实验中模型组大鼠KYN/TRP升高，中药复方加味温胆汤可以降低KYN/TRP比值，即可抑制IDO的活性。临床实验研究表明，当机体处于应激等状态下，免疫激活，IDO、犬尿氨酸酶、3-羟基氨基苯甲酸加氧酶的活性增加，导致KYN神经毒性代谢产物增加，而神经保护产物减少，促进了神经细胞的损伤退变，因此，可以通过KYN/KYNA、KYN/QUIN比值间接的判断TRP-KYN通路中神经保护/毒性的比例关系[12-13]。本实验中，抑郁模型组大鼠血清KYN/KYNA比值升高，KYN/QUIN比值降低，加味温胆汤组结果与模型组相反，但和西药氟西汀组药效相似。

本研究采用国内外公认且常用的CUMS抑郁模型[14]，通过观测宏观表征、检测和抑郁症密切相关的TRP-KYN代谢通路分子含量的变化，探究加味温胆汤抗抑郁作用机制。结果显示，加味温胆汤能增加抑郁模型大鼠的糖水偏好值、提高旷场实验得分，具有确切的抗抑郁作用；血清分子检测提示加味温胆汤能促进具有神经保护作用代谢产物KYNA的生成，抑制具有神经毒性作用代谢产物3-HKYN、3-HAA和QUIN的生成，升高KYN/QUIN比值，降低KYN/KYNA比值。

综上所述，加味温胆汤可能是通过调控TRP-KYN代谢通路，抑制神经毒性代谢途径，使代谢向神经保护途径倾斜，从而发挥抗抑郁作用。